基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四神煎治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制*

付靜思，姜泉，夏聰敏，但文超，鞏勛，岳銘，唐曉頗

1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)疼痛、變形、功能損傷為主要臨床癥狀的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，由于其高致殘率和多臟器損害而嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。目前，西醫(yī)對RA的治療以控制炎癥、調(diào)節(jié)免疫功能為主，臨床主要使用的藥物有非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS)、糖皮質(zhì)激素、抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)和生物制劑等。然而，這些藥物長期應(yīng)用可引起肝腎功能損害、胃腸道不適、骨質(zhì)疏松等多種不良反應(yīng)[2]。臨床實踐證實，中藥復(fù)方治療RA具有療效確切、不良反應(yīng)小的特點。四神煎作為調(diào)治氣陰兩虛型RA的常用方[3]，有益氣養(yǎng)陰、祛風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒之功效，其最早記錄于清·鮑相墩《驗方新編·兩膝疼痛》，全方由生黃芪(半斤)、遠志(三兩)、牛膝(三兩)、石斛(四兩)、金銀花(二兩)組成，用以治療鶴膝風(fēng)。近年來，臨床以四神煎為基本方加減治療RA取得滿意的療效。名老中醫(yī)岳美中先生善用四神煎治療關(guān)節(jié)炎，并在《岳美中論醫(yī)集》中稱贊四神煎“隨治隨效”；馮興華教授重視專病專方，推崇應(yīng)用四神煎專治氣陰兩傷兼有瘀血、痰濁、濕熱阻絡(luò)之RA[4]。動物實驗證明，四神煎聯(lián)合甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)對RA的作用效果較單用MTX更佳[5]；不同劑量的四神煎湯劑均可緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足部腫脹，顯著降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎癥因子的水平，且可以改善肝腎功能，作用效果優(yōu)于陽性對照藥雷公藤多苷片[6]。然而，目前關(guān)于四神煎的物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療RA的作用機制仍未闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、計算機技術(shù)、藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)等有機組合的新興學(xué)科。基于生物信息學(xué)，構(gòu)建“疾病-靶點-藥物”的多級網(wǎng)絡(luò)，分析它們之間的關(guān)聯(lián)，進而在蛋白質(zhì)、分子和基因水平上明確藥物對疾病的作用機制[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲取四神煎組方中藥的主要活性成分，分析其治療RA的主要作用靶點及相關(guān)通路，從物質(zhì)基礎(chǔ)和分子水平探索四神煎治療RA的作用機制，為四神煎的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四神煎活性成分及其相關(guān)靶點篩選采用中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(encyclopedia of traditional chinese medicine，ETCM)[8]、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]檢索并獲取四神煎組方中藥(黃芪、金銀花、牛膝、石斛、遠志)的化學(xué)成分，并結(jié)合文獻進行篩選、補充。將所得到的化學(xué)成分名稱輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)進行檢索，獲得化學(xué)成分的SMILES結(jié)構(gòu)式及2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss ADME數(shù)據(jù)庫，以胃腸吸收(gatrointestinal absortion)結(jié)果為“HIGH”，且五種類藥性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)結(jié)果中有2個及2個以上是“YES”為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，所得化合物即為活性化合物。將篩選后的活性化合物的SMILES結(jié)構(gòu)式或2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[10]，研究對象設(shè)置為人源基因，篩選出置信度(probability)≥0.6的靶點。將得到的靶點去除重復(fù)后，導(dǎo)入Universal Protein(Uniprot)數(shù)據(jù)庫[11]規(guī)范靶點名稱，最終獲得藥物相關(guān)靶點。

1.2 RA疾病靶點篩選以“rheumatoid arthritis”作為關(guān)鍵詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫(Gencards，https：//www.genecards.org)[12]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[13]及DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca)[14]中檢索RA的潛在靶點。將從4個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點去除重復(fù)后，導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點名稱，最終獲得RA疾病靶點。

1.3 “藥物-疾病”共同靶點的獲取及蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將四神煎活性成分相關(guān)靶點及RA疾病靶點導(dǎo)入生物信息學(xué)與進化基因組學(xué)(Bioinformatics & Evolutionary Genomics)在線軟件作圖工具平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行映射，獲得“藥物-疾病”共同靶點，即為四神煎活性成分治療RA的關(guān)鍵靶點，并繪制韋恩圖(Venn diagram)。應(yīng)用String 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)[15]分析“藥物-疾病”共同靶點之間的作用關(guān)系，設(shè)定Organism為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值(minimum required interaction score)為“highest confidence(>0.9)”，同時隱藏網(wǎng)絡(luò)中的無關(guān)聯(lián)節(jié)點(hide disconnected nodes in the network)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)生物功能分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析將“藥物-疾病”共同靶點導(dǎo)入Metascape平臺(https：//metascape.org/)[16]，分別進行基因本體(gene ontology，GO)生物功能分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析，設(shè)置P<0.01，將獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn)進行可視化，并將排行前20的條目繪制GO生物功能分析柱狀圖和KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.5 “藥物成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，然后應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析儀(network analyzer)功能獲得各成分、靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，獲得四神煎發(fā)揮治療RA作用的重要活性成分及核心靶點。

2 結(jié)果

2.1 四神煎活性成分及其相關(guān)靶點通過ETCM、TCMSP數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻檢索獲得四神煎化學(xué)成分，經(jīng)Swiss ADME數(shù)據(jù)庫進行篩選后，共獲得66個四神煎活性成分，其中金銀花17個、黃芪16個、牛膝16個、遠志9個、石斛8個，去除五味藥物中重復(fù)成分后，最終獲得槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)等60個四神煎活性成分。將獲得的60個活性成分的SMILES結(jié)構(gòu)式或2D結(jié)構(gòu)式上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，預(yù)測得到藥物作用靶點，去除重復(fù)靶點后，共得到四神煎活性成分相關(guān)靶點353個。見表1。

表1 四神煎活性成分信息

表1 四神煎活性成分信息

2.2 RA疾病靶點以“rheumatoid arthritis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank四個數(shù)據(jù)庫中分別檢索得到1084個、45個、128個、151個RA的潛在靶點。去除重復(fù)靶點后，將潛在靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名稱規(guī)范，共獲得1277個RA潛在靶點。

2.3 “藥物-疾病”共同靶點及PPI網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用Bioinformatics & Evolutionary Genomics在線平臺將353個四神煎活性成分靶點與1 277個RA疾病靶點進行映射，并繪制Venn圖，最終得到“藥物-疾病”共同靶點151個。將獲得的151個“藥物-疾病”共同靶點上傳至String 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含151個節(jié)點和616條邊。見圖1，圖2。

圖1 “藥物-疾病”共同靶點Venn圖

2.4 GO生物功能和KEGG 通路富集分析將151個“藥物-疾病”共同靶點導(dǎo)入Metascape平臺，進行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析，以P<0.01為主要篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO生物功能條目 2 322 條，其中生物過程(biological processes，BP)2 089 條，主要涉及細胞因子介導(dǎo)的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)、對脂多糖的應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)、對細菌源分子的應(yīng)答(response to molecule of bacterial origin)、對有毒物質(zhì)的應(yīng)答(response to toxic substance)、對細菌的應(yīng)答(response to bacterium)條；細胞組分(cellular components，CC)79條，主要涉及膜筏(membrane raft)、質(zhì)膜筏(plasma membrane raft)、囊腔(vesicle lumen)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、膜微區(qū)(membrane microdomain)等；分子功能(molecular functions，MF)154條，主要涉及細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等。KEGG通路富集分析共獲得174個信號通路，主要涉及白細胞介素-17信號通路(interleukin-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。見圖3，圖4及表2。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖4 GO分析柱形圖

表2 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 “藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)共有230個節(jié)點，978個相互關(guān)系。藍色六邊形代表藥物活性成分，黃色菱形代表作用靶點，綠色V形代表信號通路；節(jié)點越大、顏色越深表示自由度(degree)度值越高。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析儀(network analyzer)功能分析網(wǎng)絡(luò)中各成分、靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)。degree度值反映網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點具有聯(lián)系的節(jié)點數(shù)目，度值越高，參與的生物過程越多，可據(jù)此判斷出四神煎發(fā)揮治療RA作用的重要活性成分及核心靶點。主要活性成分的網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示，槲皮素degree度值為80，介度0.243 458，接近中心性0.484 848；木犀草素degree度值37，介度0.059 619，接近中心性0.408 759；山柰酚degree度值34，介度0.086 115，接近中心性0.414 815；漢黃芩素degree度值28，介度0.031 893，接近中心性0.392 982。主要靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示，degree度值最高靶點基因為PTGS2，degree度值為39，介度0.135 553，接近中心性 0.443 564；其次為PTGS1、RELA、TNF、NFKB1、JUN、MAPK14、MAPK1、ESR1、IL-6。表3及表4，見圖5。

表3 主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果(degree度值前10位)

表4 主要作用靶點網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果

圖5 “藥物成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，初起病因病機為素體虧虛、外感風(fēng)寒濕熱之邪，患者一般病程較長，風(fēng)寒濕邪郁而化熱，耗傷氣陰，形成氣陰兩虛、邪氣阻絡(luò)之證[4]。四神煎作為臨床治療氣陰兩虛型RA的經(jīng)典方劑，方中重用黃芪為君，振奮正氣以驅(qū)散經(jīng)隧深部之邪氣；金銀花可清熱解毒；牛膝可補益肝腎兼通利關(guān)節(jié)；遠志可祛痰消腫；石斛可養(yǎng)陰生津；諸藥合用切中病機，既補已損之氣陰，又驅(qū)除經(jīng)絡(luò)之郁邪。四神煎治療RA的作用機制仍不清楚，因此，本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析四神煎治療RA的潛在作用機制。

本研究共挖掘出四神煎活性成分60個，藥物潛在靶點353個，RA疾病相關(guān)靶點1 277個，“藥物-疾病”共同靶點151個。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)四神煎主要通過調(diào)控IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化、破骨細胞分化、NF-κB信號通路等生物學(xué)途徑發(fā)揮抑制炎癥和免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨代謝的作用。①抑制炎癥和免疫反應(yīng)。TNF通路是RA發(fā)病機制中的經(jīng)典通路，TNF-α作為通路中最早參與的細胞因子，可促進IL-1、IL-6 的分泌，刺激滑膜細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，引起滑膜炎癥。Th17細胞分化通路介導(dǎo)CD4+T細胞分化為Th17細胞，Th17細胞是以分泌IL-17為主的T細胞亞群，IL-17是RA患者關(guān)節(jié)滑膜損傷的重要因素之一，它可與IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子協(xié)同，募集中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞到關(guān)節(jié)局部浸潤，引起滑膜組織增生[17-19]。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是引起炎癥反應(yīng)的重要信號通路，同時因為體內(nèi)炎癥因子的刺激會造成NF-κB的自分泌自擴增循環(huán)，進一步加重關(guān)節(jié)損壞[20]。②調(diào)節(jié)骨代謝。破骨細胞是骨骼系統(tǒng)中具備骨吸收功能的細胞，RA骨破壞的機制與破骨細胞的生成活化密切相關(guān)，抑制破骨細胞分化通路對于延緩RA骨破壞具有重要意義。人體內(nèi)骨代謝的重要通路包括NF-MMPs受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/NF-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/骨保護素(osteoprotegerin，OPG)信號通路和Wingless/Integrated(Wnt)信號通路等。IL-17通過介導(dǎo)RANKL表達，調(diào)控破骨細胞的分化，促進骨破壞的發(fā)生；還可促進軟骨細胞中MMPs的分泌，分解軟骨蛋白聚糖及膠原，破壞軟骨組織[21]。TNF通過刺激骨細胞表達RANKL，激活破骨細胞形成，直接導(dǎo)致骨破壞[22]；還可通過上調(diào)Wnt信號通路拮抗劑DKK-1的表達，抑制成骨細胞介導(dǎo)的骨形成，間接導(dǎo)致骨破壞[23]。NF-κB 信號通路受到細胞因子(如RANKL、TNF-α 和IL-1)的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，通過誘導(dǎo)破骨細胞分化破壞軟骨細胞[24]。此外，關(guān)鍵靶點還富集在糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、癌癥通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路，提示四神煎對氣陰兩虛型糖尿病、癌癥、動脈粥樣硬化等疾病亦有治療效果。

對四神煎主要活性成分進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn)，degree度值較高的活性成分為：槲皮素、木犀草素、山柰酚及漢黃芩素等。研究表明，槲皮素可以劑量依賴的方式減少RA成纖維樣滑膜細胞中IL-6、IL-1β等細胞因子的分泌，抑制炎癥反應(yīng)[25]；還可通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)MMP-13的表達，從而延緩RA軟骨破壞，發(fā)揮保護軟骨細胞的作用[26]。木犀草素可減少MMP的分泌，抑制炎癥因子的表達[27]。木犀草素或木犀草素與綠原酸聯(lián)用可顯著下調(diào)IL-1β刺激的成纖維樣滑膜細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)、Janus激酶1(janus kinases，JAK1)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcriptions 3，STAT3)的表達，進而抑制JAK-STAT信號通路的激活[28]。這些結(jié)果表明，木犀草素可抑制RA成纖維樣滑膜細胞的增殖，阻斷成纖維樣滑膜細胞的致病作用。山柰酚通過拮抗堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)的RSK2表達，抑制RA成纖維樣滑膜細胞的增殖和遷移、Th17的分化和破骨細胞的形成[29]。漢黃芩素具有抗炎的作用，可以濃度依賴的方式增加RA成纖維樣滑膜細胞內(nèi)活性氧含量，進而降低關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[30]。由此推測，槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素等成分可能是四神煎治療RA的重要活性成分，且這些成分可通過抑制炎癥和免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨代謝發(fā)揮治療作用。

對四神煎治療RA的作用靶點進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn)，degree值較高的PTGS2、PTGS1、TNF、IL-6等均為RA臨床常用藥物的作用靶點。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxidase synthase，PTGS)也稱環(huán)氧合酶(cyclooxy genase，COX)，是目前臨床治療RA常用的非甾體類抗炎藥的作用靶點，其中PTGS1(COX-1)可參與調(diào)節(jié)機體正常生理活動；PTGS2(COX-2)可在IL-6、TNF-α等細胞因子的誘導(dǎo)下迅速表達，催化前列腺素(prostaglandin，PG)參與炎癥反應(yīng)[31]。TNF抑制劑和 IL-6 受體拮抗劑為臨床常用生物制劑，可較快緩解病情、降低疾病活動度[32]。TNF包括TNF-α和TNF-β，TNF-α是RA發(fā)病過程中最早參與的細胞因子，參與機體免疫或炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)促進 IL-1、IL-6和MMPs的釋放，激活破骨細胞分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩。滑膜成纖維細胞在炎癥因子的刺激下可分泌IL-6，IL-6可誘導(dǎo)Th17和破骨細胞分化，促進急性期蛋白合成，增強與滑膜增生和關(guān)節(jié)破壞有關(guān)的炎癥反應(yīng)[22]。

綜上所述，四神煎可通過多成分、多靶點、多通路抑制炎癥和免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨代謝發(fā)揮對RA的治療作用。本研究為后續(xù)開展四神煎的機制研究提供線索，為四神煎的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于數(shù)學(xué)模型及生物信息學(xué)的研究方法，未涉及藥代動力學(xué)、血清藥物化學(xué)等領(lǐng)域，故仍存在一些問題亟待解決，比如藥物提取濃縮過程中化學(xué)成分的變化、藥物在人體內(nèi)代謝發(fā)生的變化、藥物之間的配伍關(guān)系等，因此本研究結(jié)果需經(jīng)過動物或細胞實驗進一步驗證，為四神煎治療RA提供更堅實可靠的科學(xué)依據(jù)。