牛蒡子苷元調控CTRP6對七氟烷麻醉后大鼠炎癥反應和認知功能障礙的影響*

王鵬程，楊揚，崔明珠，李治松

1.黃淮學院直屬附屬駐馬店市中心醫院，河南 駐馬店 463000； 2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003； 3.鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014

麻醉是現代醫學診療過程中重要的輔助手段，但全身麻醉可能會對機體產生不良的影響，甚至誘發神經毒性[1]。既往研究證實，麻醉引發的神經毒性與氧化應激、神經性炎癥及神經元凋亡等密切相關，但其具體作用機制尚不清楚[2-4]。七氟烷是目前臨床上使用較為廣泛的吸入性麻醉劑，長時間及過量的七氟烷吸入會嚴重損害神經系統功能，包括神經系統發育、空間學習記憶能力等[5-7]。海馬作為大腦中樞神經系統中最為復雜的部位，其損傷時會引起學習減退、記憶能力降低及認知功能障礙等[8-9]。既往研究顯示，七氟烷能夠通過促進炎性因子表達，誘導海馬神經元凋亡，導致大鼠認知功能障礙[10]。但是，有關七氟烷對海馬神經損傷的調控機制尚不完全清楚，因此，探尋七氟烷對認知功能障礙的機制并予以干預治療尤為重要。

中醫藥干預治療對于改善大鼠麻醉后炎癥反應和認知功能障礙具有重要作用。2020年版《中華人民共和國藥典》記載牛蒡子具有疏散風熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效，治療感冒發熱、癰腫化膿、丹毒痄腮等疾病效果顯著。新近研究發現，牛蒡子具有抗炎和改善學習記憶等作用[11]。牛蒡子苷元是從中藥牛蒡子中提取得到的木脂類化合物，具有抗炎、抗氧化及神經保護等作用[12]。研究表明，牛蒡子苷元能夠通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)信號通路改善阿爾茨海默病小鼠學習和記憶能力障礙[13]。在弓形蟲誘導的BALB/c小鼠神經精神疾病模型中，牛蒡子苷元能夠通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號通路減輕小鼠神經性炎癥[14]。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白6(C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)是與炎癥反應密切相關的一類脂肪因子蛋白超家族成員。研究發現，CTRP6能夠通過調節Akt/NF-κB信號通路影響高糖誘導的腎小管間質細胞炎性反應[15]。因此，本研究旨在探究牛蒡子苷元能否通過調節CTRP6/Akt/NF-κB信號通路改善七氟烷誘導的大鼠神經性炎癥及認知功能障礙，為七氟烷不良反應的預防提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物雄性SPF級6周齡SD大鼠50只，體質量200～220 g，購于鄭州大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(豫)2019-0025。動物飼養在SPF級飼養室內，晝夜12 h/12 h交替，室內溫度(25±2) ℃，期間自由飲食，飲水。動物實驗經過駐馬店中心醫院動物倫理委員會審核批準，倫理批號：202002003。

1.2 藥品與試劑七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司，批號：65170507)；牛蒡子苷元(武漢科斯坦生物科技有限公司，純度≥98%，批號：HB-01110)。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，濟南世紀通達化工有限公司，批號：CAS67-68-5)；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Sigma公司，批號：RAB0311、RAB0277、RAB0479)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、原位缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidy transferase mediated nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體、β-actin抗體(上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0105S、C1088、P0009、A0239、A0192、AF5001)；CTRP6抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體(英國Abcam公司，批號：ab36898、ab8805、ab38449、ab32536、ab76302)；CTRP6免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司，批號：SP-9001)。

1.3 儀器TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓科技有限公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(離心半徑：20 cm)、FC型全自動多功能酶標檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；1658033型電泳儀、ChemiDoc XRS+成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 藥物制備稱取適量牛蒡子苷元，采用 200 μL DMSO進行溶解，使其終濃度分別為1 g·mL-1和0.05 g·mL-1，4 ℃條件下保存備用。

2.2 大鼠分組、造模及干預50只雄性SPF級SD大鼠按照隨機數字表法分為對照組、七氟烷組及牛蒡子苷元低(5 mg·kg-1)、中(10 mg·kg-1)、高(20 mg·kg-1)劑量組，每組10只。除對照組外，其余組大鼠進行6%七氟烷吸入性麻醉，3 h后自然蘇醒，對照組大鼠不做任何處理。牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠在七氟烷吸入麻醉前腹腔注射 200 μL 牛蒡子苷元溶液，對照組和模型組大鼠給予等體積DMSO。給藥48 h后進行相關指標的檢測。

2.3 Morris水迷宮實驗定位航行實驗：5組大鼠連續訓練3 d，訓練時，將大鼠從面向池壁的4個入水點放入水中，記錄大鼠從入水到明確找到并站立于水下隱蔽平臺的時間，即為逃避潛伏期。每只大鼠從池壁的4個入水點分別訓練1次，每次間隔時長30 s。訓練結束后，每組隨機選取6只大鼠進行實驗。空間探索行為實驗：在定位航行實驗結束后，撤去平臺，大鼠從池壁的同一入水點放入水中，記錄大鼠在60 s內穿越原平臺的次數，即為穿臺指數。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清炎癥因子水平大鼠麻醉后，心臟取血，4 ℃，3 000 r·min-1離心 10 min，取其上清，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠海馬組織病理形態各組大鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，每組隨機取6只大鼠腦組織，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%多聚甲醛固定各組大鼠海馬組織，脫水、透化、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組大鼠海馬組織形態學變化。

2.6 TUNEL染色觀察海馬神經元凋亡按“2.5項”下操作制備石蠟切片，按照TUNEL法測定大腦海馬神經元凋亡。其中，細胞核呈熒光綠色的細胞為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。

細胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細胞數目/細胞總數目×100%

2.7 免疫組化檢測大鼠海馬組織CTRP6的表達每組取6只大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠海馬組織，脫水、透化、包埋、石蠟切片，組織切片厚度為3～5 μm，采用3%H2O2溶液孵育10 min消除內源性過氧化物酶，85 ℃抗原修復，加入10%BSA溶液封閉20 min。加入CTRP6抗體(1:200)，4 ℃條件下孵育過夜。加入對應羊抗兔IgG抗體(1:2 000)，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，利用Image Pro Plus軟件進行圖像分析，評估CTRP6蛋白的表達水平。

2.8 Western Blot檢測海馬組織CTRP6、Akt、p-Akt、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達水平取大鼠海馬組織進行研磨，裂解。BCA法測定蛋白質濃度，凝膠電泳，濕轉法轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加Akt抗體(1:1 000)、p-Akt抗體(1:1 000)、NF-κB抗體(1:1 000)、p-NF-κB(1:1 000)抗體、CTRP6抗體(1:500)及β-actin抗體(1:2 000)，4 ℃孵育過夜。加對應的羊抗兔IgG抗體(1:5 000)或羊抗鼠IgG抗體(1:5 000)，孵育1～2 h。加含吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次5 min，加入顯影液，顯影并拍照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 牛蒡子苷元對大鼠學習記憶能力的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠逃避潛伏期時間顯著延長(P<0.05)，穿臺指數顯著降低(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短(P<0.05)，穿臺指數顯著增加(P<0.05)。見圖1。

注：A：逃避潛伏期；B：穿臺指數；與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.2 牛蒡子苷元對大鼠血清炎癥因子含量的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 牛蒡子苷元對大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

3.3 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織形態學的影響對照組大鼠海馬CA1區神經元結構完整、清晰，細胞呈極性排列；七氟烷組大鼠海馬CA1區神經元數量顯著減少，細胞排列紊亂，細胞大部分皺縮，部分神經元細胞核固縮、染色質出現明顯聚集；牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬CA1區病理性損傷明顯減輕。見圖2。

圖2 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織病理變化的影響(HE，×200)

3.4 牛蒡子苷元對大鼠海馬神經元凋亡的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬CA1區神經元凋亡指數顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬CA1區神經元凋亡指數均顯著降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 牛蒡子苷元對大鼠海馬神經元凋亡的影響(TUNEL染色)

注：與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.5 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織CTRP6表達的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織CTRP6表達顯著降低(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬組織CTRP6表達均顯著增加(P<0.05)。見圖5。

注：A：免疫組化染色結果；B：Western Blot檢測結果；與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.6 牛蒡子苷元對Akt/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著增加(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注：與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

4 討論

七氟烷吸入性麻醉與大腦記憶功能損傷密切相關，會誘發患者短暫性學習和記憶下降，其機制與抑制海馬CA1區錐體神經元電壓門控通道相關[16-17]。另外，七氟烷還可誘發海馬組織氧化應激及炎性反應，從而促進神經元凋亡[18-19]。研究發現，海馬神經過度炎癥性反應及細胞凋亡是誘導認知功能障礙的重要機制。中醫藥治療在改善海馬神經損傷及認知功能障礙中發揮重要作用。既往研究發現，具有和表解里、疏肝升陽功效的蘇郁膠囊能夠抑制海馬神經細胞凋亡[20]；具有健脾益智作用的定志小丸能夠通過促進海馬CA3區神經元細胞增殖，保護海馬結構，從而改善慢性應激大鼠行為[21]。藥食同源的牛蒡子始載于《名醫別錄》，味辛、苦，性寒，主要用于疏散風熱、利咽消腫、疹出不暢、解毒透疹等癥。牛蒡子含有多種成分，具有廣泛的藥理作用。研究發現，牛蒡子主要活性成分之一牛蒡子苷元廣泛應用于神經系統性疾病的治療，能夠改善精神性疾病小鼠海馬神經炎性反應及認知功能障礙[12]。本研究結果顯示，七氟烷吸入性麻醉大鼠CA1區海馬神經元數量顯著減少，細胞排列紊亂，細胞大部分皺縮，部分神經元細胞核固縮、染色質明顯聚集，學習功能減退、記憶能力下降，并伴有血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的增加，海馬神經元凋亡指數增加，進一步證實海馬神經炎性反應及細胞凋亡與大鼠認知功能障礙密切相關。牛蒡子苷元干預后大鼠海馬CA1區病理性損傷減輕，學習記憶功能明顯好轉，血清促炎因子 IL-6、IL-1β、TNF-α含量以及海馬神經元凋亡指數降低，表明牛蒡子苷元能夠通過抑制海馬神經炎性和細胞凋亡改善七氟烷誘發的大鼠認知功能障礙。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細胞增殖、存活、葡萄糖代謝、凋亡以及血管生成等生物學功能中發揮重要作用[22-23]。研究表明，Akt廣泛表達于機體各種組織，p-Akt是其活化形式[24-25]，能激活NF-κB，促進IκB與NF-κB解離，形成具有活性的p-NF-κB亞甲基，使其順利進入細胞核，進而促進相關炎性細胞因子表達，最終導致炎性反應發生[26-27]。既往研究證實，七氟烷吸入性麻醉大鼠海馬組織Akt磷酸化水平增加[28]。本研究結果顯示，與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著升高；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平均顯著降低，表明牛蒡子苷元可通過調控Akt/NF-κB信號通路抑制海馬神經炎性反應和細胞凋亡，從而改善大鼠認知功能障礙。

CTRP6是脂肪因子蛋白超家族成員之一，廣泛參與組織炎癥及纖維化過程。既往研究表明，CTRP1、CTRP3及CTRP9與缺血性腦卒中患者神經功能損傷密切相關[29-31]。在腦出血小鼠腦神經損傷模型中，鼻腔內注射重組CTRP6能夠通過脂聯素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB 通路抑制神經炎癥反應，從而減輕腦水腫和神經功能[32]。本研究通過免疫組織化學和Western Blot檢測顯示，與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織CTRP6表達顯著降低，提示CTRP6可能與海馬神經炎性反應相關；牛蒡子苷元干預后，大鼠海馬組織CTRP6表達顯著升高，提示牛蒡子苷元可通過上調CTRP6的表達改善七氟烷誘發的大鼠神經功能損傷，進而改善七氟烷誘發的大鼠認知功能障礙。既往研究證實，敲低CTRP6能夠抑制高糖誘導的腎小管間質細胞氧化應激、炎性反應及細胞外基質沉積，其機制與調控Akt/NF-κB信號通路相關[15]。

綜上所述，牛蒡子苷元能夠明顯改善七氟烷麻醉誘發的大鼠神經性炎癥反應和認知功能障礙，其作用可能與調控CTRP6/Akt/NF-κB信號通路有關。