三七不同部位提取物體外抗氧化功效研究*

查雨鋒，詹易，李婷，顏宏，黃加文，吳德松

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111； 2.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111

衰老是一種復雜的自然現象，是由遺傳基因和環境等多種因素共同影響所導致的必然結果[1]。中醫理論認為，衰老是由于先天稟賦不足，后天調攝失宜，造成人體精華物質耗散，五臟功能體系虛損，產生形體衰憊、生命機能減退等現象[2]。在現代眾多醫學理論中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)學說是最具有說服力的學說之一[3]。ROS是機體在生化反應中產生的性質活潑、具有極強氧化功能且可導致機體衰老的物質，體內過多的ROS可導致氧化應激的發生[4]。皮膚作為人體最大的器官，直接暴露于環境，更容易引起氧化應激造成氧化損傷[5]。氧化應激引起的細胞氧化損傷在機體衰老中扮演重要角色，因此，抑制ROS產生，促進其清除，并抑制其引起的細胞氧化損傷，對預防衰老具有重要意義。

三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]為五加科人參屬草本植物，又名田七、金不換等，主產于我國云南、廣西等地[6]，是我國的傳統名貴中藥材，歷代本草均有收載。三七性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經，具有散瘀止血、消腫定痛的作用[7]。現代藥理學研究表明，三七在血液循環系統、心腦血管系統、中樞神經系統、免疫系統等方面均具有重要作用[8-10]。研究證明，三七總皂苷、多糖、總黃酮、人參二醇、picrionoside B、槲皮素等均具有抗氧化作用[11-16]，提示三七具有良好的抗衰老功效。近年來，三七的抗氧化作用被不斷證實，這不僅為尋找其新的臨床適應證研究提供了理論基礎，同時也為三七化妝產品的開發提供了新的方向。但截至目前，針對三七抗氧化作用的研究中，大多僅限于單一部位的提取物或成分，而三七不同部位的抗氧化功效是否具有差異性還未見相關文獻報道，這給化妝品原料用藥部位的選擇帶來了困難?；诖耍狙芯坎捎皿w外抗氧化評價方法，對三七根、莖、葉、花四個部位的抗氧化功效進行較為全面的研究，以篩選出抗氧化活性較優的部位，為三七化妝品原料的選擇提供實驗基礎，同時為三七資源的合理開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞人皮膚成纖維細胞(human foreskin fibroblasts，HFF-1)，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號：SCSP-109。

1.2 藥物與試劑維生素E(vitamin E，VE)、MTT(德國Sigma-Aldrich公司，貨號：T3251、M2128)；DMEM 高糖培養基、胎牛血清、胰酶、PBS緩沖液(美國Gibco公司，貨號：8115251、10099-141、25200-056、8115183)；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A001-3、A006-2、A003-4-1)；VC、無水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：A303539、B1805051)；二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150702)；Ⅲ型膠原蛋白(type Ⅲ collagen，Col Ⅲ) ELISA試劑盒(上海樊克生物科技有限公司，貨號：FK-0437)；ColⅠ ELISA試劑盒(英國Abcam公司，貨號：ab210966)。

1.3 儀器Practum224 SQP型電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；AC2-6S1型二級生物安全柜、CCL-170A-8型CO2恒溫培養箱(新加坡ESCO公司)；3H12RI型高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司，離心半徑：7.5 cm)；DMIL-LED型倒置相差顯微鏡(德國萊卡公司)；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Multiskan GO型全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取三七干燥根、莖、花、葉進行粉碎，過24目篩制得藥材粉末，分別用70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾后合并提取液?；厥杖軇瑵饪s提取液，加入6倍體積的純水，充分攪拌后置于2～8 ℃冰箱過夜，過濾，濾液濃縮成浸膏，冷凍干燥得三七根、莖、花、葉粗提物。分別稱取三七不同部位提取物各20.0 mg，乙醇充分溶解后，配制成濃度為12.5 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1、200.0 mg·L-1、400.0 mg·L-1、800.0 mg·L-1的三七不同部分提取物溶液，4 ℃保存待用。

2.2 羥自由基清除活性檢測按照參考文獻[17]的方法，取10 mmol·L-1FeSO4、2 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、5 mmol·L-1H2O2及不同濃度的三七不同部位提取物溶液各1 mL，混勻，于37 ℃水浴中反應1 h。實驗選擇VC作為陽性對照，其余操作均相同。在波長510 nm處測量吸光度，根據吸光度值計算自由基清除率，采用OriginPro 8.5軟件計算半抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)。

2.3 超氧陰離子自由基清除活性檢測按照參考文獻[17]的方法，取0.1 mL不同濃度的三七不同部位提取物溶液分別與5 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2，0.05 mol·L-1)混合，25 ℃水浴20 min，加入0.2 mL鄰苯三酚(3 mmol·L-1)，25 ℃水浴 4 min。實驗選擇VC作為陽性對照，其余操作均相同。于325 nm波長處測定吸光度，根據吸光度值計算自由基清除率，采用OriginPro 8.5軟件計算IC50。

2.4 MTT檢測三七不同部位提取物對正常細胞活力的影響取對數生長期HFF-1細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，用含有15%胎牛血清的DMEM培養液懸浮細胞，調整細胞密度為1.0×105mL-1，接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，培養24 h。用培養液將VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物分別配制成濃度為12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1的工作液，0.22 μm無菌濾膜過濾備用。棄除細胞上清液，加入100 μL配制好的VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物工作液，每個濃度設置5個復孔，空白對照組加入100 μL DMEM培養液，培養24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h 后棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，避光放置 30 min 后，在570 nm波長處測定各孔吸光度(optical density，OD)值[18-19]，根據公式計算細胞活力，并根據細胞活力確定以下實驗的給藥劑量。

細胞活力(%)=樣品組OD值/空白組OD值×100%

2.5 細胞形態學觀察選擇對數生長期HFF-1細胞，調整細胞密度為1.0×105mL-1，接種于6孔細胞培養板，每孔2 mL，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h。棄除培養液，將細胞分為空白對照組、模型組、陽性對照(VE)組、三七根提取物組、三七莖提取物組、三七葉提取物組、三七花提取物組，每組設置5個復孔?？瞻讓φ战M每孔加入2 mL DMEM培養液，其他組每孔加入含900 μmol·L-1H2O2的培養液2 mL，培養6 h建立氧化損傷模型。棄除上清液，空白對照組和模型組每孔加入2 mL DMEM培養液，各給藥組分別加入含50 mg·L-1VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物的培養液2 mL，培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

2.6 MTT法測定三七不同部位提取物對氧化損傷模型細胞活力的影響將對數生長期HFF-1細胞，按1.0×105mL-1的密度接種于96孔細胞培養板，每孔100 μL，培養24 h。實驗分組及模型建立同“2.5項”，每組設置5個復孔。模型建立完成后，棄除上清液，空白對照組和模型組加入DMEM培養液100 μL，各給藥組分別加入含50 mg·L-1VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物的培養液100 μL，按“2.4項”所述方法測定細胞活力。

2.7 氧化損傷模型HFF-1細胞內MDA、SOD及GSH的測定實驗方法與“2.5項”相同，藥物干預HFF-1細胞24 h后，棄除上清液，用PBS清洗細胞兩次，每孔加入400 μL純水，-80 ℃反復凍融3次裂解細胞，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液備用。嚴格按照試劑盒說明書操作，采用MDA、SOD和GSH試劑盒檢測上清液中MDA、GSH含量及SOD活力。

2.8 氧化損傷模型HFF-1細胞內Col Ⅰ、Col Ⅲ的測定細胞處理方法與“2.7項”相同，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA試劑盒檢測細胞中Col Ⅰ及Col Ⅲ的水平。

3 結果

3.1 三七不同部位提取物對自由基清除活性的影響三七根、莖、葉、花提取物對超氧陰離子及羥自由基均具有清除作用，其中，三七根提取物對超氧陰離子及羥自由基清除的IC50最小。提示三七根提取物的自由基清除活性優于其他部位提取物。見表1。

表1 三七各部位提取物對自由基清除活性的影響

3.2 三七不同部位提取物對正常細胞活力的影響與空白對照組比較，VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物分別在 200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1及以下濃度時對HFF-1細胞的活力無明顯抑制作用(P>0.05)，表明VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物在此濃度及以下濃度對HFF-1細胞均無毒性，后續實驗藥物濃度設定為50 mg·L-1。見圖1。

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.3 三七不同部位提取物對氧化損傷模型HFF-1細胞形態的影響空白對照組HFF-1細胞呈梭形或多角形，細胞數量較多且飽滿圓滑；模型組細胞數量明顯減少，部分細胞皺縮變圓，折光率偏高，呈現出典型的損傷形態；與模型組比較，三七各部位提取物組細胞明顯增多，細胞形態得到較好改善，其中三七根提取物對HFF-1細胞損傷的改善效果最好。見圖2。

注：A：空白對照組；B：模型組；C：VE組；D：三七根提取物組；E：三七莖提取物組；F：三七葉提取物組；G：三七花提取物組

3.4 三七不同部位提取物對氧化損傷模型細胞活力的影響與空白對照組比較，模型組HFF-1細胞活力明顯降低(P<0.001)，表明氧化損傷模型建立成功；與模型組比較，三七不同部位提取物均能不同程度的升高HFF-1細胞活力(P<0.01)；與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七根提取物組、三七葉提取物組HFF-1細胞活力顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：與空白對照組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.5 三七不同部位提取物對HFF-1細胞中MDA、SOD及GSH的影響與空白對照組比較，模型組HFF-1細胞中MDA含量明顯升高(P<0.001)，SOD活力和GSH含量明顯降低(P<0.001)，表明氧化損傷模型建立成功。與模型組比較，三七根、莖、葉提取物均能不同程度的升高細胞內SOD活力及GSH含量(P<0.05)，降低細胞內MDA的含量(P<0.05)；三七花提取物顯著升高細胞內GSH含量(P<0.05)，并降低細胞內MDA的含量(P<0.05)，但對細胞內SOD活力沒有影響(P>0.05)。與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七葉提取物組及三七花提取物組HFF-1細胞中SOD活力及GSH含量顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：與空白對照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.6 三七不同部位提取物對HFF-1細胞內Col Ⅰ、Col Ⅲ的影響與空白對照組比較，模型組細胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ的含量明顯降低(P<0.001)。與模型組比較，三七根、莖、葉、花提取物均能明顯提高細胞中Col Ⅰ的含量(P<0.05)；三七根提取物能明顯提高細胞中Col Ⅲ的含量(P<0.01)，而其余組對細胞中Col Ⅲ的含量無影響(P>0.01)。與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七葉提取物組及三七花提取物組HFF-1細胞內Col Ⅰ的含量顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注：與空白對照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 討論

自由基是機體在生化反應中產生的性質活潑并具有極強氧化功能且可導致機體快速衰老的物質，在化學結構上，其外層軌道上含有一個或一個以上未配對電子的分子、原子、離子或基團[20]。人體內的自由基主要以氧自由基為主，大約占自由基總數的95%，氧自由基主要指超氧陰離子自由基和羥自由基，其可引發不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，使糖類、蛋白質、核酸及脂類等發生氧化損傷，導致細胞衰老和死亡，引起廣泛的關注[21-22]。抑制或清除機體內過多的自由基，可避免或減少氧化應激所引起的氧化損傷。本研究聚焦體內數量最多、危害最大的兩類氧自由基，采用快速、靈敏和實用的體外超氧陰離子及羥自由基清除實驗研究三七不同部位的抗氧化活性。結果顯示，三七根、莖、葉、花提取物均具有超氧陰離子及羥自由基清除活性，具有較好的抗氧化作用，其中，三七根提取物對超氧陰離子及羥自由基清除的IC50最小，其自由基清除活性優于其他部位提取物。

皮膚成纖維細胞是組成皮膚真皮的主要結構成分，是維持皮膚結構穩定的重要組成部分，也是皮膚衰老和細胞受損后的主要修復細胞[23]。HFF-1 細胞來源于人包皮皮膚成纖維細胞，被廣泛應用于皮膚抗衰老研究。H2O2作為氧化劑，可誘導細胞發生氧化應激反應，致使細胞內抗氧化物質耗竭，氧化物質增多，導致細胞內氧化還原系統失衡，最終導致細胞損傷和凋亡，被廣泛用于體外細胞過氧化損傷模型的造模[24]。MDA可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞氧化損傷的程度，而SOD和GSH是體內主要抗氧化物質，能夠清除體內自由基，對維持機體細胞中氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[25]。膠原蛋白作為一種重要的細胞外基質蛋白，是人體皮膚的主要組成成分之一。人皮膚中的膠原蛋白主要包括ColⅠ和ColⅢ，為皮膚提供強度和支撐，膠原蛋白肽的分解和流失是皮膚衰老最典型的象征[26]，因此，細胞中膠原蛋白的含量可間接反映細胞衰老的程度。本研究結果顯示，三七不同部位提取物干預氧化損傷模型HFF-1細胞后，可不同程度的提高細胞內的抗氧化物質水平，降低氧化物質的產生，提高細胞活力及細胞中膠原蛋白的合成，且三七根提取物抗氧化功效最為顯著。

本研究發現，三七不同部位提取物的抗氧化作用具有明顯差異。據文獻報道，三七中具有抗氧化作用的成分主要有總皂苷、多糖、總黃酮、人參二醇、槲皮素等[11-16]，而這些成分在三七根、葉、花部位基本都有發現[27-30]，推測，三七不同部位的抗氧化功效可能是由其抗氧化成分的含量所決定。

綜上所述，三七根、莖、葉、花提取物均具有抗氧化功效，且三七根提取物的抗氧化功效最為顯著，是三七化妝品原料的最佳選擇部位。本文為三七化妝品原料的研究及三七資源的進一步開發利用提供實驗依據和理論基礎。