八寶丹體外抑制淋巴管生成的作用機制研究*

關建華，逯遙，黃彬，2，蘭煒蘭，林久茂，2

1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122； 2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122

惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康，腫瘤轉移是惡性腫瘤的一大生物學特征，其中淋巴道轉移不僅是腫瘤轉移的一個主要途徑[1]，還是判斷預后的一個重要依據[2]。關于腫瘤的淋巴道轉移大多認為是腫瘤通過誘導淋巴管生成之后所產生的現象，與淋巴管的生成密切相關[3]。因此，抗腫瘤相關淋巴管生成可能成為抑制腫瘤轉移新的治療策略[4]。八寶丹(babao dan，BBD)屬于名貴藥物，由麝香、牛黃、羚羊角、蛇膽、三七和珍珠等中藥組成，具有清熱利濕、活血解毒、祛黃止痛等功效，在惡性腫瘤治療及輔助治療方面有著良好的效果[5]。研究表明，BBD可通過抑制腫瘤細胞自噬抑制腫瘤細胞生長[6]。本課題組前期研究發現，BBD可抑制人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和胃癌細胞的增殖、遷移，并誘導胃癌細胞凋亡[7-10]；還可通過調控血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)/血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)信號通路抑制胃癌血管生成[11]。然而，BBD能否抑制淋巴管生成尚未可知，故本研究對此進行探索。

1 材料

1.1 細胞人淋巴內皮細胞(human lymphatic endothelial cells，HLECs，貨號：JNO-061)采購于廣州吉妮歐生物技術有限公司。

1.2 藥物與試劑BBD(廈門中藥廠股份有限公司，批號：180101)。Hoechst33258染色試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，貨號：KGA211)；MTT粉末、結晶紫(北京索萊寶科技有限公司，貨號：M8180、C8470)；內皮細胞培養基(endothelial cell medium，ECM，美國ScienCell公司，貨號：SC1001)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，美國Life Technologies公司，貨號：SH30256.01B)；Transwell遷移小室(美國Corning公司，貨號：3422)；管腔試劑盒(德國Merck Millipore公司，貨號：ECM625)；Western封閉液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0023B)；VEGFR-3一抗(美國Abcam公司，貨號：ab27278)；β-actin一抗、VEGF-C一抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG (H+L)抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG (H+L)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：66009-1-lg、22601-1-AP、SA00001-1、SA00001-2)；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP-2)(D2O4T)兔單克隆抗體、MMP-9(D6O3H)XP?兔單克隆抗體(美國CST公司，貨號：87809S、13667S)；Western專用一抗二抗稀釋液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：14C12B17)。

1.3 儀器Galaxy 17型二氧化碳培養箱(德國Heraeus公司)；Infinite M200型多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；IC1000型Countes?全自動細胞計數儀(美國Life Technologies公司)；DFC425型熒光顯微鏡、DMIL LED型倒置顯微鏡系統(德國Leica儀器有限公司)；超高靈敏度化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 藥物制備使用PBS將BBD配置成濃度為25 g·L-1的溶液，超聲30 min助溶后，采用培養基配成所需要的濃度(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)。

2.2 細胞培養HLECs采用ECM完全培養基(ECM基礎培養基500 mL、胎牛血清25 mL、內皮細胞生長因子5 mL和青-鏈霉素雙抗 5 mL)于5%CO2及飽和濕度的37 ℃培養箱中培養。

2.3 細胞增殖檢測采用MTT法對細胞增殖進行檢測分析。取對數生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種于96孔培養板中，每孔100 μL。當細胞匯合度至50%～60%時，每孔加入含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養液100 μL，分別培養24 h和 48 h 后，棄掉原培養液，加入0.5 g·L-1MTT溶液，每孔100 μL，4 h后棄掉MTT，每孔加入100 μL DMSO，室溫孵育10 min，充分振蕩混勻，采用酶標儀檢測570 nm處的光密度(optical density，OD)值，評估細胞增殖。

細胞增殖(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%

2.4 細胞形態觀察取對數生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種于6孔培養板中，每孔接種2 mL。當細胞匯合度至50%～60%時，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養基干預24 h后，棄掉原培養基，每孔加入0.5 mL PBS進行清洗，倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

2.5 細胞凋亡實驗取對數生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種到12孔板中，每孔接種1 mL。當細胞匯合度至50%～60%時，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養基干預24 h后，棄掉原培養基，每孔加入0.5 mL PBS進行清洗，4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，棄上清液，采用Hoechst33258染液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并拍照記錄。

2.6 細胞劃痕損傷修復實驗取對數生長期的HLECs，按3×105·mL-1的密度接種于6孔培養板中，每孔接種2 mL。當細胞匯合度至90%左右時，用小規格槍頭垂直于6孔板底，并按照一定力度進行水平劃痕，棄掉原培養基并使用PBS清洗3次，拍照記錄后使用含不同濃度的BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)干預，于 12 h 后觀察細胞劃痕損傷修復情況。

2.7 細胞遷移實驗含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養基干預對數生長期的HLECs 24 h后，消化并收集細胞，細胞重懸混勻后密度調整為2.5×105·mL-1，取200 μL重懸液加入遷移小室內，700 μL ECM完全培養基置于室外，恒溫箱孵育12 h后棄掉培養基，使用4%多聚甲醛固定后采用結晶紫染色10 min，超純水清洗并晾置干燥，倒置顯微鏡下觀察BBD對HLECS遷移的影響，并隨機選取5個視野拍照。

2.8 管腔形成實驗于低溫環境中預先配置基質膠并鋪置于48孔板中，恒溫培養箱孵育1 h。將HLECs按照2×105·mL-1的密度接種于含有基質膠的48孔板中，每孔200 μL，3 h后通過倒置顯微鏡觀察HLECs的管腔形成情況。

2.9 Western Blot檢測淋巴管生成相關蛋白表達水平采用Western Blot檢測HLECs中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平。HLECs以1.0×105·mL-1的密度接種于6孔板，當匯合度達到50%～60%時，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養基干預24 h后收集細胞，提取總蛋白并進行定量定體積。SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為10%，蛋白上樣量為50 μg，轉膜。室溫下使用Western封閉液封閉2 h，加一抗[VEGF-C(1:3 000)、VEGFR-3(1:1 000)、MMP-2(1:1 000)、MMP-9(1:1 000)和β-actin(1:5 000)]，4 ℃孵育14 h～18 h。室溫條件下TBST洗滌3次，每次10 min，加二抗(1:5 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，使用超高靈敏度化學發光成像系統顯影并分析。

3 結果

3.1 BBD對HLECs增殖的影響與0 g·L-1BBD組比較，干預24 h及48 h后，0.25 g·L-1BBD組、0.5 g·L-1BBD組及0.75 g·L-1BBD組HLECs的增殖能力明顯降低(P<0.01)。見圖1。

注：與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01

3.2 BBD對HLECs形態的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD組HLECs出現細胞密度減少，部分細胞脫落的現象，且呈現明顯的劑量依賴性。提示BBD對HLECs生長有著抑制作用，并呈現劑量依賴性。見圖2。

圖2 BBD對HLECs形態的影響(×200)

3.3 BBD對HLECs凋亡的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD組HLECs的細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與0.25 g·L-1BBD組比較，0.5 g·L-1BBD組和0.75 g·L-1BBD組HLECs的細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與0.5 g·L-1BBD組比較，0.75 g·L-1BBD組HLECs的細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。提示BBD能夠促進HLECs凋亡，且呈現明顯的劑量依賴性。見圖3。

注：A：細胞凋亡圖(×200)；B：各組細胞凋亡率結果比較；與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

3.4 BBD對HLECs損傷修復能力的影響與0 g·L-1BBD組比較，經其余濃度BBD干預后，HLECs向劃痕區域愈合的速度逐漸減緩，細胞損傷的修復能力逐漸減弱。提示：BBD可抑制HLECs損傷修復能力。如圖4。

圖4 BBD對HLECs損傷修復能力的影響(×100)

3.5 BBD對HLECs遷移能力的影響0 g·L-1BBD組細胞可以成功遷移，證明HLECs自身具有遷移能力。與0 g·L-1BBD組比較，經其余濃度BBD干預后，HLECs的遷移率顯著降低(P<0.01)，且呈現濃度依賴性。提示：BBD具有抑制HLECs遷移的作用。見圖5。

注：A：細胞遷移圖(×200)；B：細胞遷移率統計結果圖；與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

3.6 BBD對HLECs管腔生成能力的影響0 g·L-1BBD組HLECs有較多的管腔生成，提示HLECs自身具有較好的管腔生成能力。與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD干預后，HLECs管腔生成數量顯著減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。提示，BBD能夠抑制HLECs的管腔生成。見圖6。

注：A：管腔生成圖(×100)；B：管腔生成率統計結果圖；與0 g·L-1 BBD組比較，*P<0.05；與0.25 g·L-1 BBD組比較，#P<0.05；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△P<0.05

3.7 BBD對HLECs中淋巴管生成相關蛋白表達水平的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD干預HLECs 24 h后，HLECs中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2與MMP-9蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。提示，BBD可抑制HLECs中淋巴管生成相關蛋白的表達水平。見圖7。

注：A：HLECs中淋巴管生成相關蛋白免疫印疫圖；B：各組HLECs中淋巴管生成相關蛋白結果比較；與0 g·L-1 BBD組比較，*P<0.05，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，#P<0.05，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

4 討論

研究發現，淋巴道轉移是惡性腫瘤對人類生命健康的最大威脅[12-13]，因此，抑制淋巴管生成是目前研究抗腫瘤轉移的熱點之一。VEGF由多種組織細胞分泌，是腫瘤血管生成的重要指標，對腫瘤淋巴道轉移有著至關重要的作用[14]。VEGF-C作為目前發現的唯一特異性血管生長因子，與其特異性受體VEGFR-3成為目前公認的促進淋巴管生成關鍵因子[15]。研究證實，VEGF-C與VEGFR-3結合后，可以促進HLECs的增殖、遷移，促進淋巴管生成[16-17]。

細胞外基質在腫瘤轉移的過程中發揮著重要作用，與細胞外基質完整性相關的基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)與腫瘤的轉移及預后密切相關[18-19]。MMP-9能夠降解細胞外基質Ⅳ型膠原及基底膜，促進腫瘤細胞的浸潤與轉移，還能夠促進內皮細胞的遷移和新血管生成，從而促進腫瘤的發生發展[20-21]。MMP-2與MMP-9能夠共同發揮降解多種細胞外基質蛋白的作用，如IV型膠原、層粘連和纖維連接蛋白[22]。Ⅳ型膠原是構成細胞外基質和基底膜的主要蛋白，MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，在血管基底膜降解的早期發揮重要作用。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達可有效防止血管基底膜降解，進而減少腫瘤血管的生成[23]。研究證明，MMP-2與MMP-9表達水平的高低與腫瘤轉移密切正相關[18，24-25]，推測，MMP-2與MMP-9蛋白表達水平與淋巴管生成及遷移密切相關。

近年來的研究發現，中草藥提取物乃至復方制劑在辨證論治的基礎上，運用中醫理論來指導用藥，對腫瘤的發生發展及轉移有重要影響[26]。如川芎具有活血化瘀的功效，對惡性腫瘤的侵襲和轉移有一定的治療效果[27]；解毒消癥飲對體外血管生成有著一定程度抑制作用[28]；清解扶正顆粒能有效抑制體外淋巴管生成[29]。BBD同樣具有清熱利濕，活血解毒的功效，其是否能夠一定程度上抑制淋巴管生成尚未可知。因此，本研究選擇人淋巴內皮細胞為研究對象，考察BBD在體外抑制淋巴管生成的能力。

MTT及Hoechs33258染色實驗發現，隨著BBD濃度增加，對HLECs增殖的抑制作用逐漸增加，促凋亡能力也逐漸增加，說明BBD能夠抑制HLECs增殖，促進HLECs凋亡；細胞劃痕實驗和Transwell實驗發現，BBD能夠抑制HLECs的損傷修復能力及遷移能力，且呈現明顯劑量依賴性；管腔形成實驗及Westem Blot檢測發現，BBD能夠抑制HLECs的管腔生成能力，顯著下調淋巴管生成相關蛋白VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2及MMP-9蛋白表達水平。

綜上所述，BBD可以促進HLECs凋亡，抑制HLECs增殖、遷移及淋巴管的生成，其作用可能與下調VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平有關。