鎖陽乙酸乙酯提取物對阿爾茨海默病小鼠腸道菌群紊亂的調節作用*

李鑫潔，陳建新，魯藝

北京中醫藥大學，北京 100029

鎖陽為鎖陽科植物鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質莖[1]，主要分布于我國西北部荒漠地域，素有“沙漠人參”之稱[2]。在中醫臨床中，鎖陽常用于治療腎陽虛引起的陽痿、不孕、腰膝酸軟及腸燥津枯引起的大便干燥等[3]。基于天然中草藥具有多成分、多功效、不良反應小等特點，現代研究者對鎖陽進行了大量研究，以求在各個領域發揮最大的利用價值。中醫認為，阿爾茨海默病的發病機理是腎精不足、腦髓漸空，臨床上常選用補腎益精中藥來治療與阿爾茨海默病相似的癥狀，如記憶力減退，理解能力降低、情緒低落等。研究表明，中藥鎖陽的乙酸乙酯提取物可有效改善小鼠的學習和記憶障礙[4]，提高氧化損傷模型SK-N-SH人神經母細胞瘤細胞的存活率[5]，具有體外神經細胞保護作用。

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)不僅嚴重影響病人自主活動、自理能力，給身邊親屬帶來精神和心理壓力[6]。目前，關于阿爾茨海默病的發病假說有很多，如Aβ蛋白沉積、Tau蛋白異常等，但并沒有開發出效果甚佳的藥物。隨著腸道微生物組學研究的迅速發展，有學者提出“微生物-腦-腸軸”假說，認為AD的治療也可以從腸道菌群方向開展[7]。研究表明，腸道菌群失調在AD的發生發展中發揮著一定的作用，調節腸道菌群可以減少Aβ蛋白沉積、降低Tau蛋白過度磷酸化、減輕炎癥反應等方式改善AD的癥狀[8-9]。如由于益生菌的不斷減少，機體抵抗力下降，炎癥反應加劇，神經細胞將不能進行正常的生理活動而凋亡，從而引發AD[10]。因此，本課題以AD轉基因模型小鼠為研究對象，基于腸道菌群豐度與多樣性的變化，探討鎖陽乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of cynomorium songaricum，ECS)對AD模型小鼠腸道菌群紊亂的調節作用。

1 材料

1.1 動物8周齡雄性SPF級5xFAD阿爾茨海默病轉基因小鼠16只，體質量20～30 g，購買于上海虔碧生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0006。使用PCR及電泳技術檢測小鼠的基因組DNA，鑒定小鼠為5xFAD阿爾茨海默病轉基因小鼠。8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠8只，體質量20～30 g，購買于北京維通利華實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK(滬)2017-0011。所有小鼠單籠飼養，自由攝食和飲水，并按照動物中心飼養標準飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房(溫度 20～25 ℃，光照和黑暗各12 h)，定期觀察小鼠生長情況，按時更換墊料、飼料及飲用水，適應性飼養1周后用于實驗研究。本實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審查通過，倫理批號：BUCM-4-2019083002-3102。

1.2 藥物與試劑鎖陽(北京國醫堂，產地：內蒙古，貨號：701002539)。乙醇(純度：≥95%)、乙酸乙酯(純度：≥99%)、石油醚(純度：≥99%)、生理鹽水(北京通廣精細化工廠，貨號：101057、101028、105119、111541)；Illumina Nextera 試劑盒、QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(北京奧維森基因科技有限公司，貨號：1311001、56104)。

1.3 儀器BSA223S-CW型分析天平(德國賽多利斯股份有限公司)；101FAB-2型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；R-1001型旋轉蒸發儀(上海增森儀器科技有限公司)；Sigma1-15PK型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；KW-MWM 型Morris 水迷宮系統(南京卡爾文生物科技有限公司)；BW-YLS-3TB型小鼠跳臺記錄系統(上海軟隆科技發展有限公司)；Dura Pro型組合式超純水系統(美國Millipore公司)；Illumina Miseq高通量測序儀(北京德利卡生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備根據實驗室前期研究基礎，將鎖陽飲片用10倍量的70 %乙醇浸泡過夜，超聲提取3次，每次1 h，收集提取液，抽濾，加熱回流，濃縮直至無醇味。加少量水溶解，石油醚萃取4～5次，收集下層水層。乙酸乙酯萃取收集的水層4～5次，萃取至無色，收集上層有機層，合并萃取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮，干燥，得黃棕色粉末，稱重，測得ECS提取率為2.36%。經鑒別，該粉末中雜質<2%，總灰分<12%，符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。

2.2 分組與給藥適應性飼養1周后，8周齡5xFAD小鼠隨機分為模型組和ECS組，以野生型C57BL/6小鼠為對照組，每組8只。ECS組小鼠以20 mL·kg-1的劑量灌胃給予47 mg·kg-1ECS，對照組和模型組分別灌胃等量去離子水，每天1次，連續84 d。

2.3 Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)實驗直徑1.2 m的黑色圓柱形水池注水，使水平面高于站立平臺1～2 cm，水溫保持在25 ℃左右，加適量牛奶變為乳白色，并將圓柱形水池分為西北(northwest，NW)、東北(northeast，NE)、東南(southeast，SE)、西南(southwest，SW)四個象限，用數字攝像機實時記錄小鼠的運動軌跡和時間，并用軟件分析。前4天為隱匿平臺學習訓練，每天4次，隨機從不同的象限面朝池壁放入，若小鼠在60 s內找到平臺，允許其在平臺上休息30 s，記錄搜索到平臺的時間(即為逃避潛伏期)；小鼠在60 s內未找到平臺，則由實驗者將其引向平臺且同樣休息30 s。第5天進行空間探索實驗，撤去平臺，將小鼠從西北象限放入，記錄60 s內小鼠穿越原平臺次數。

2.4 跳臺實驗跳臺箱為黑色長方形，被黑色隔板劃分為5個“小房間”，每個“小房間”中心均為大小統一的白色絕緣體高站臺，跳臺箱底部為通電流的銅柵。設置電流大小為30 mA，通電時間為300 s，將腳底沾濕的小鼠置于高站臺，正常情況下，當小鼠接觸到底部銅柵后，會被電擊而跳回高站臺。小鼠有一定的電擊記憶儲存時間，所以短期內不會繼續下跳。此實驗為期2天，第1天為學習階段，讓小鼠具有一定的電擊記憶，學習階段若小鼠未跳下站臺則棄去；第2天為測試階段，記錄小鼠第一次跳下絕緣站臺的時間(即為跳臺潛伏期)及300 s內受到電擊的次數(即為錯誤次數)，以此反映小鼠的記憶功能。

2.5 微生物多樣性測序及分析

2.5.1 糞便樣品的收集實驗動物完成所有行為學實驗后，禁食不禁水12 h。按4 mL·kg-1的劑量腹腔注射1 %戊巴比妥麻醉小鼠，迅速解剖取出小鼠腸組織，用無菌鑷子取出2粒糞便(約200 mg左右)，迅速轉移至滅菌的凍存管中，于-80 ℃保存備用。獲得糞便樣本共24個，每組8個。

2.5.2 基因提取及PCR擴增和純化根據QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書提取糞便樣本中的總DNA，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳對得到的DNA進行檢測并定量。使用通用引物(F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴增細菌16S rDNA 的V3～V4區。所有樣品上樣量為10 ng，每個樣本重復檢測3次。反應體系：1 μL正向引物，1 μL反向引物，10 μg DNA模板，10 μL HiFi buffer，加超純水補至20 μL。反應條件：95 ℃反應3 min，95 ℃反應30 s，72 ℃反應30 s，60 ℃反應30 s，循環20次，再72 ℃反應3 min，4 ℃存放24 h后，室溫下加入 16 μL 磁珠，5 min后置于磁架上進行分層，棄去上清液。加入200 μL乙醇，室溫放置揮發乙醇。加入40 μL水后吹打，靜置5 min，置于磁架上分層，取上清液移至離心管中。配制25 μL反應物(1 μL正向引物+1 μL反向引物+2 μg DNA模板+12.5 μL HiFi buffer+超純水)，按上述條件進行再次擴增，4 ℃ 存放24 h后，重復上述PCR純化步驟，最終將擴增純化好的PCR存于新的離心管中。

2.5.3 Miseq文庫構建及上機測序連接“Y”字形(外懸)接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段后，利用PCR擴增進行Miseq文庫模板的富集，使用氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。DNA片段與引物堿基互補，固定在芯片上，另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋”(Bridge)，PCR擴增后產生DNA簇，DNA擴增子線性化成為單鏈后，加入改造過的DNA聚合酶及帶有4種熒光標記的dNTP。每次循環只合成一個堿基，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類，將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3′端黏性，繼續聚合第二個核苷酸，統計每輪收集到的熒光信號結果。

2.5.4 多變量統計分析將相似度大于97 %的有效序列聚合成為一個操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)，進行物種分類。基于OUT進行Alpha多樣性分析(包括稀釋曲線、chao1指數、observed species指數、PD whole tree指數及shannon指數分析)及物種分析(包括物種組成分析、屬水平進化發生樹、物種聚類柱狀圖及熱圖分析)；基于unifrac進行Beta多樣性分析[包括主坐標分析(principal coordinates analysis，PCOA分析)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA分析)]等。采用LEfSe分析，找出不同組間在豐度上存在顯著性差異的物種。

2.6 統計學方法檢測結果均采用SPSS 20軟件進行統計學分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，繼以進行LSD多重比較，P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 MWM實驗結果與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)，穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，ECS組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺次數顯著增加(P<0.05)。提示，ECS可顯著改善AD模型小鼠的空間記憶與學習能力。見圖1。

注：A：不同時間各組小鼠逃避潛伏期結果比較；B：各組小鼠穿越平臺次數結果比較；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 跳臺實驗結果與對照組比較，模型組小鼠跳臺潛伏期明顯縮短(P<0.05)，且錯誤次數顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，ECS組小鼠跳臺潛伏期顯著延長(P<0.05)，且錯誤次數明顯減少(P<0.05)；提示，5xFAD小鼠有記憶下降的特征，且ECS可顯著改善AD模型小鼠的記憶能力。見圖2。

注：A：各組小鼠跳臺潛伏期結果比較；B：各組小鼠跳臺錯誤次數結果比較；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 數據質控及OTU分析糞便樣本共24個，總共獲得有效序列2511096條，所測樣本中最高序列條數為276135，最低序列條數為130384。使用 UPARSE聚類法共生成975個OTU，按樣本最低序列條數進行抽平處理，得到924個OTU。在OTU水平上對不同樣本間的異同進行統計，并通過Venn圖展現不同樣本之間共有或特有的OTUs。結果顯示，對照組OTU 757個，模型組OTU 651個，ECS 組OTU 730個，提示，AD小鼠的菌群多樣性降低，給予ECS干預后，小鼠的菌群多樣性明顯升高；對照組與模型組非共有的OTU 330個，表明，AD小鼠糞便菌群組成發生顯著變化；ECS 組與模型組非共有OTU 215個，對照組與ECS組非共有OTU 295個，表明 ECS 可改善5xFAD小鼠糞便菌群多樣性。見圖3。

注：顏色代表分組；數字表示各組間特有或共有的OTU數目

3.4 Alpha多樣性分析

3.4.1 稀釋性曲線分析隨機抽取樣本，計算并作圖，其中X軸代表每個樣本隨機抽取的序列條數，Y軸代表隨機抽取序列的OTU數量，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理。結果表明，每個樣本隨機抽取的序列條數與OTU數量曲線均趨向于平坦狀態，表明各組小鼠糞便樣本取樣數量合理。見圖4。

注：C：對照組；M：模型組；E：ECS

3.4.2 Alpha多樣性指數分析Alpha多樣性指數分析可以反映一個特定區域環境內的微生物群落豐富度和多樣性，observed_species指數反映實際觀測到的OTU數目，chao1和PD whole tree 指數用于估算樣本OTU總數，這三種指數都反應樣本群落真實的物種數量，即群落豐富度；而shannon指數用于估算樣品中群落多樣性，值越大，則群落多樣性越高。chao1與observed species指數結果顯示，與對照組比較，模型組群落豐富度顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，ECS組群落豐富度顯著上升(P<0.05)。PD whole tree指數和Shannon指數結果顯示：各組間微生物的豐富度和多樣性均無明顯差異(P>0.05)。見圖5。

圖5 Alpha多樣性指數分析

3.5 Beta多樣性分析

3.5.1 PCoA與PLS-DA分析對各組樣本進行多元化統計分析，研究樣本組內或組間群落整體組成的差異性或相似性。結果顯示：模型組與對照組明顯聚為兩類，表明模型組與對照組的微生物物種存在顯著差異；ECS組與模型組明顯聚為兩類，且向正常組靠近，表明給予ECS后，AD小鼠的腸道微生物組成得到明顯的改善，趨于恢復正常。見圖6。

注：A：PCoA分析圖；B：PLS-DA分析圖

3.5.2 Hcluster分析聚類分析(hierarchical cluatering，Hcluster)是一種樹枝結構，用于闡述和比較樣本間微生物進化的相似性和差異性，基于群落組成關系的距離矩陣，運用非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)進行聚類。結果顯示，對照組、模型組和ECS組各組組內樣本的微生物進化相似；與對照組比較，5xFAD小鼠腸道菌群結構發生了顯著變化，而ECS可以顯著改善5xFAD小鼠糞便菌群的整體結構。見圖7。

注：C：對照組；M：模型組；E：ECS組

3.6 物種分析

3.6.1 物種組成分析

3.6.1.1 門水平(Phylum)結果顯示，OTU主要歸至細菌界的7個門，分別是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、Saccharibacteria(TM7)、軟壁菌門(Tenericutes)和藍細菌門(Cyanobacteria)，其中厚壁菌門和擬桿菌門所占豐度最高。與對照組比較，模型組擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門豐度上升；與模型組比較，ECS組擬桿菌門豐度上升，而厚壁菌門豐度下降；ECS組與對照組細菌門的所占比例相似。見圖8-A，圖8-B。

3.6.1.2 目水平(Order)結果顯示，OTU主要歸至10個目，分別是擬桿菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、乳酸菌目(Lactobacillaceae)、彎曲桿菌目(Campylobacterales)、Coriobacteriales目、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、Gastranaerophilales目、厭氧原體目(Anaeroplasmatales)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)，其中豐度排名前四的為擬桿菌目、梭菌目、乳酸菌目及丹毒絲菌目。與對照組比較，模型組小鼠糞便中擬桿菌目、丹毒絲菌目菌群豐度降低，梭菌目菌群豐度升高；給予ECS組后，小鼠糞便中擬桿菌目、丹毒絲菌目菌群豐度升高，梭菌目菌群豐度降低。見圖8-C，圖8-D。

3.6.1.3 屬水平(Genus)結果顯示，樣本中菌群落組成中豐度前20的菌屬分別是：擬桿菌目 S24-7(Bacteroidales_S24-7_group)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、Odoribacter、理研菌屬(Rikenellaceae)、unclassified_Lachnospiraceae、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、Lachnoclostridium、Alloprevotella、螺桿菌屬(Helicobacter)、羅斯氏菌(Roseburia)、Rikenella、毛螺菌屬UCG-001(Lachnospiraceae_UCG-001)、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Allobaculum、Candidatus_Saccharimona、糞球菌屬(Coprococcus)和梭菌屬(Anaerotruncus)。與對照組比較，模型組擬桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度顯著下降(P<0.05)，而乳桿菌屬、毛螺菌科NK4A136豐度顯著上升(P<0.05)，Odoribacter有上升趨勢(P>0.05)，瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有下降趨勢(P>0.05)；與模型組比較，ECS組瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有上升趨勢(P>0.05)，并顯著增加桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度(P<0.05)，而對Odoribacter無顯著影響。見圖8-E，圖8-F。

圖8 糞便菌群不同分類水平的相對豐度柱狀圖

3.6.2 Heatmap分析通過聚類分析可將高豐富和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色相似程度或顏色變化反映樣本在不同分類水平上群落結構的相似性和差異性。結果顯示：對照組與模型組菌群結構明顯不同，給予ECS干預后，ECS組菌群結構明顯改善，趨于恢復正常。見圖9。

注：C：對照組；M：模型組；E：ECS組

3.7 Anosim分析Anosim相似性分析用來判別分組是否有意義，R值為Anosim的統計量，數值介于-1和1之間，表明組間樣品差異與組內樣品差異的差值大小。R值越接近1，表明組間樣品差異越大，同時組內樣品差異越小，分組效果越好；R=0，表明分組之間不具有統計學差異；R值越接近-1，表明組內樣品差異超過組間樣品差異，樣品分組效果較差。結果表明，三個組R值均在(0，1)間，分組有意義。P值反映了Anosim分析結果的統計學顯著性，P<0.05，表明各樣品分組之間有顯著性差異。與對照組比較，模型組有顯著性差異(P=0.001)，ECS組無顯著性差異(P=0.10)；與模型組，ECS組有顯著性差異(P=0.011)。該結果進一步說明對照組與模型組小鼠菌群存在顯著差異，而給予ESC后，小鼠菌群逐漸恢復正常。見表1。

表1 Anosim分析結果

3.8 LEfSe分析LEfSe(LDA Effect Size)分析方法可用于多組(或內部亞組)比較，設定LDA得分值>3找到組間豐富度存在顯著差異的物種。結果表明，與對照組比較，模型組的差異性物種主要集中在屬水平，分別為羅斯氏菌(Roseburia)、糞球菌-1(Coprococcus_1)、產醋菌屬(Acetatifactor)；ECS組差異性物種涉及綱、目、科、屬四個水平，其中起重要作用的前四個微生物類群分別是：擬桿菌目S24-7(Bacteroidales_S24-7_group)、普雷沃菌屬(Prevotella)、Odoribacter屬、放線菌門(Actinobacteria)；與模型組相比，ECS組差異性物種涉及門、綱、目、科、屬五個水平，其中起重要作用的前四個微生物類群分別是：擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceac)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)。見圖10。

圖10 LEfSe分析

4 討論

研究表明，腸道微生物的多樣性和豐富性與“腸-腦軸”引發的退行性疾病密切相關[11-13]。從AD患者體內獲得的糞便菌群移植到嚙齒類動物身上，會引起AD相關癥狀，并伴有海馬杏仁核和齒狀顆粒層的神經化學變化[14-16]。使用恩諾沙星對正常小鼠治療7天后，小鼠表現出空間記憶缺失等AD相關癥狀，可能與恩諾沙星誘導微生物組成的改變有關[17]。進一步研究發現，AD疾病與大鼠腸道微生物多樣性和豐富度的變化以及促炎性細胞因子的增加有關[18-20]。上述研究表明，腸道菌群的異常可能是AD發病的重要因素之一，從調節腸道菌群的角度治療AD或改善其癥狀將成為一種新的策略。中醫認為，“腎精不足，腦髓漸空”正是 AD 的發病機理，因此常選用補腎益精之藥來治療與 AD 相似的癥狀，如記憶力減退，理解能力降低、情緒低落等[21-22]。本研究選用的補腎益精中藥鎖陽，其主要成分為黃酮類化合物，已被證明具有一定的神經保護作用[23-24]。

目前針對AD并沒有較好的造模方法[25-26]，本研究選取帶有5個家族性突變基因的5xFAD小鼠，從根本上解決其他AD模型小鼠可能會出現的個體差異現象或模型不成功的問題。本研究采用水迷宮檢測小鼠的空間定位能力，結果易受視覺、運動能力及光線的影響[27]，測試需要在嚴苛特定的條件下進行。小鼠行為學結果顯示，ECS可顯著增加5xFAD小鼠的學習能力、空間記憶能力與記憶存留時間。腸道菌群結果顯示，與對照組比較，5xFAD小鼠糞便菌群群落豐富度顯著下降，門水平上，擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門豐度上升；目水平上，擬桿菌目的豐度顯著降低，而梭菌目的豐度顯著升高；屬水平上，擬桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度顯著下降，毛螺菌科NK4A136豐度顯著上升，而有益菌瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有下降趨勢。給藥ECS后，模型組菌群群落豐富度明顯改善，其中Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種注釋分析等結果均保持一致。臨床研究結果表明，AD患者的微生物物種豐度呈現擬桿菌門減少，厚壁菌門、變形菌門富集的現象，這與本研究結果一致[28-30]。

綜上所述，ECS可顯著改善AD模型小鼠的空間記憶與學習能力，調節糞便菌群紊亂。