微小RNA-29a在膝骨關節炎兔子中的表達及其對干細胞生長因子β、血管內皮生長因子表達和炎癥反應的影響

李 冕 劉宣毅 董朝軍 東 彬

(河北省滄州市人民醫院骨4科，滄州市 061000，電子郵箱：13463476668@qq.com)

膝關節作為人體主要的負重關節，會因日常工作、生活而受到損傷，出現慢性損傷性病變，進而發展為膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)。KOA是臨床上常見的關節疾病，主要以膝關節局部腫脹及關節疼痛為主要臨床表現。研究顯示，2018年我國KOA患病率為18%，其中女性患病率明顯高于男性[1]。除了高患病率，KOA還具有高致殘率、反復發作以及難以痊愈等臨床特點，如不及時給予有效的治療措施，患者極大可能會出現行走困難、癱瘓等后遺癥，日常生活質量受到嚴重影響[2]。因此，明確KOA的發病機制從而給予針對性的干預，具有重要的意義。有研究顯示，各種細胞因子介導的炎癥反應與KOA的發生、發展有密切關系[3-4]，而微小RNA(microRNA,miRNA)-29a及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也與KOA發病相關，兩者在KOA患者滑膜和關節液中的水平呈負相關[5]。還有研究表明，KOA患者的疼痛和殘疾程度與血清干細胞生長因子β(stem cell growth factor β,SCGF-β)表達顯著相關[6]。本研究分析KOA模型兔的miRNA-29a表達水平及其對SCGF-β、VEGF的表達水平及炎癥反應的影響，旨在為今后相關研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：4月齡無特定病原體級新西蘭兔48只，雌雄各半，體重(2 500.0±50.0)g，均購自河北醫科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(冀)2008-0026]，飼養條件為雌雄分籠飼養，溫度20℃～25℃，濕度維持在45%～65%之間，飼養過程中保證充足的飼料、飲水，每天清理排泄物。本研究通過了動物倫理委員會批準，符合倫理要求。

1.1.2 實驗試劑：抗SCGF-β抗體和抗VEGF抗體購自上海研盟生物科技有限公司(批號：bs-0522r、98168127)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司(批號：10010-023、11684817910)，miRNA-29a模擬物、miRNA-29a陰性對照物和miRNA-29a抑制物均購自上海吉瑪生物公司(批號：2020002、2020005、2020008)，RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：FBS00219-1、nUC0153)；總RNA提取試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒和miRNA定量檢測試劑盒均購自Invitrogen公司(批號：D1981、D1971、218161)；SCGF-β和VEGF檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(批號：0708AFC34、DVE00)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(批號：R2856c、310051)；miRNA-29a引物由上海達科為生物技術公司合成。

1.1.3 實驗儀器：H-600型透射電鏡購自日本日立公司，ABI-7500型實時熒光定量檢測儀購自美國ABI公司，BX50型光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 KOA模型建立及鑒定：參照文獻[7]的造模方法，從雌、雄兩個整體中各選取20只兔子用于建立KOA模型，即KOA組(n=40)，其余兔子為空白對照組(n=8)，建模4周后，進行干預及分組。將KOA組兔子固定于無菌實驗臺上，保持其后肢伸直，在右側膝關節處做一4 cm左右的縱向切口，切斷內側副韌帶以暴露關節腔，再依次切除內側半月板及前、后交叉韌帶，對切口進行清洗、縫合，用無菌敷料包扎后肢。術后給予兔子右側后肢肌內注射40萬U青霉素進行抗感染治療，1次/d，連續1周。術后每天驅趕兔子活動30 min，飼養條件為溫度20℃～25℃，濕度維持在45%～65%之間，飼養過程中保證充足的飼料、飲水，每天清理排泄物；密切觀察兔子的右后肢情況，發現異常情況須及時進行相關處理，例如出現切口紅腫等感染情況則要及時清潔傷口。建模4周后觀察兔子的活動情況、關節軟骨表面變化情況，以及HE染色情況以評估KOA模型是否成功。評估標準為：兔子右肢關節活動明顯受限，關節軟骨表面可見凹陷，HE染色可見軟骨表層有裂隙、軟骨細胞層次不清晰、排列無序。

1.2.2 抗SCGF-β抗體、抗VEGF抗體干預：建模4周后，將KOA組兔子按隨機數字表法分為非干預組、SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組，每組8只，其余8只進行模型鑒定，每組雌雄各半。給予SCGF-β組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL的抗SCGF-β抗體稀釋液+1 mL生理鹽水，給予VEGF組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL的抗VEGF抗體稀釋液+1 mL生理鹽水，給予SCGF-β+VEGF組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL 的抗SCGF-β抗體稀釋液+1 mL 10 μg/mL的抗VEGF抗體稀釋液，空白對照組與非干預組兔子通過耳靜脈注射2 mL生理鹽水，1次/d，共干預1周，干預1周后檢測兔血清炎性指標水平。

1.2.3 KOA軟骨細胞的制備：干預1周完成采血后，采用耳靜脈空氣注射法處死非干預組兔子，以兔子右側股骨內側為切口，分層切開組織，打開兔子膝關節腔，觀察關節液及關節軟骨面情況，并在無菌操作環境中摘取關節軟骨，剝離軟骨膜與筋膜后，取0.5 mm左右的軟骨組織碎塊，放入培養瓶內，采用含雙抗(青霉素濃度為100 U/mL，鏈霉素的濃度為0.1 mg/mL)的PBS沖洗組織3次，每次沖洗3 min；加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫下進行消化2 h，再加入0.02%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫下進行消化20 h。培養瓶內加入杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；上海聯碩生物科技有限公司，批號：20201223)終止消化反應，用200目濾網對吹打后過濾細胞，收集濾液，室溫(25℃)下3 500 r/min離心5 min后去除上清液，加入低糖(1.0 g/L)DMEM培養基重懸，在5% CO2、37℃培養箱中孵育24 h后處理。

1.2.4 細胞轉染：取上述制備的KOA軟骨細胞接種于六孔板中，細胞接種密度為2×105個/L，用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中進行培養，等細胞融合度達到90%以上時，按照Lipofectamine 2000說明書(上海恪敏生物科技有限公司，批號：20210819)進行轉染，隨機分為正常組、miRNA-29a模型組(Mimic組)、miRNA-29a陰性對照組(NC組)和miRNA-29a抑制組(Inhibitor組)，每組設6個復孔。正常組不予轉染。模型組用miRNA-29a模擬物轉染至細胞，NC組用miRNA-29a陰性對照物轉染至細胞，Inhibitor組將含miRNA-29a反向互補片段的抑制物轉染至細胞。將各組質粒與脂質體混合物分別加入已標記的對應孔板中，輕搖使其均勻分布于孔板內；再將細胞孵育6 h后換液，先用PBS清洗3次，保證清洗充分，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養7 d，3 d進行一次換液。

1.2.5 miRNA-29a相對表達水平的檢測：干預1周后抽取各組兔子耳靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液。利用總RNA提取試劑盒提取各血清樣本和各組轉染后的細胞中的總RNA，在NanoDrop2000分光光度計(上海如海光電科技有限公司)上定量。取1 μg RNA進行反轉錄反應，設置反應條件為37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃。配制實時熒光定量PCR反應體系(寡核苷酸0.5 μL、4種dNTP 3 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、靶系列DNA和PCR反應緩沖液2.5 μL)，用U6作為內參，用定量PCR儀進行miRNA-29a相對表達水平的檢測，設置反應條件為95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 35 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-29a相對表達水平。miRNA-29a引物序列正義鏈為5′-GAGTTGACCACAGCACCTC-3′，反義鏈為5′-GAGACATCGTGGTAGACTTT-3′；U6引物序列正義鏈為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗檢測血清SCGF-β、VEGF、TNF-α及CRP表達水平：干預1周后抽取各組兔子耳靜脈血1.5 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗分別檢測各組實驗兔血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP表達水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測轉染細胞SCGF-β和VEGF蛋白的相對表達水平：取各組轉染后的細胞，利用細胞裂解液(北京百奧萊博科技有限公司，批號：Z808072)裂解細胞，提取細胞總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(上海生工生物有限公司，批號C503021)對提取的總蛋白進行定量，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃保存備用。設置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印。取聚偏二氟乙烯膜用TBST洗膜5 min，共3 次，加入含2%牛血清白蛋白的TBS緩沖液配制的封閉液進行封閉，室溫搖床孵育2 h。 洗膜后加入一抗(上海恒遠生物科技有限公司，批號：A91102205)(1 ∶200)4℃孵育過夜，再加入二抗(上海恒遠生物科技有限公司，批號：A91205204)(1 ∶1 000)室溫下孵育1 h。將新鮮配制的化學發光試劑液滴加到聚偏二氟乙烯膜表面，轉移至成像分析系統暗箱中曝光，采集圖像并分析。以GAPDH為內參進行分析，以相對灰度值代表蛋白相對表達量，實驗至少重復3次。

1.2.8 實時熒光定量PCR檢測轉染細胞SCGF-β和VEGF mRNA的相對表達水平：取各組轉染后的細胞,用TRIzol法(美國Life technologies公司，批號：15596-303)提取總RNA，按照PCR反轉錄試劑盒(Invitrogen公司，批號：11752050)說明書進行反轉錄，設置實時熒光定量PCR反應體系(10×擴增緩沖液2.5 μL，4種dNTP混合物3 μL，引物1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，Mg2+1.5 μL，三蒸水30 μL)，設置反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算SCGF-β 和VEGF mRNA的相對表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 KOA模型鑒定結果 空白對照組兔子膝骨關節活動自如，關節軟骨表面均勻光滑，HE染色顯示軟骨細胞分布均勻、排列整齊。KOA組兔子右肢關節活動明顯受限，關節軟骨表面可見凹陷，HE染色顯示軟骨表層有裂隙、軟骨細胞層次不清晰、排列無序。見圖1。

圖1 兔子膝骨關節軟骨組織(HE染色，×200)

2.2 各組兔子血清指標的比較 5組血清miRNA-29a、SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP表達水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中，與空白對照組相比，非干預組、SCGF-β組、VEGF組及SCGF-β+VEGF組的血清miRNA-29a相對表達水平均降低，而血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP水平均升高(均P<0.05)；與非干預組和VEGF組比較，SCGF-β組和SCGF-β+VEGF組血清SCGF-β表達水平均降低；與非干預組和SCGF-β組比較，VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清VEGF表達水平均降低；與非干預組比較，SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP表達水平均降低(P<0.01)，且SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP表達水平均低于SCGF-β組和VEGF組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組兔子血清指標的比較(x±s)

2.3 轉染后4組軟骨細胞miRNA-29a相對表達水平的比較 4組軟骨細胞的miRNA-29a相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，正常組及NC組miRNA-29a相對表達水平低于Mimic組，高于Inhibitor組；且Inhibitor組miRNA-29a相對表達水平低于Mimic組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組軟骨細胞miRNA-29a相對表達水平的比較(x±s)

2.4 轉染后3組軟骨細胞中SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對表達水平的比較 4組轉染軟骨細胞SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對表達水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中，3組轉染軟骨細胞SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對表達水平均為Inhibitor組>NC組>Mimic組(均P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測結果

表3 各組軟骨細胞中SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

由于受到倫理道德等因素的限制，往往在人體上不能直接進行實驗研究，只能選用理想的動物模型代替。動物模型中對動物的選擇直接關乎實驗成敗，因此，選擇實驗動物時除了考慮是否容易控制、飼養、費用、倫理等因素，同時也要兼顧動物基因與人類基因的相似性以及疾病發病機制的相似性[8]。KOA模型的建模方法多種多樣，通過基因敲除、手術誘發、關節內注射誘發等方法均可得到理想的KOA模型。兔子性格溫順，其膝關節面較鼠類大，關節內操作方便，且關節的大體外觀與人相似，可用于實驗的組織較多，而且既往研究提示采用前交叉韌帶橫斷法可成功建立KOA模型[9-11]。因此，本次實驗研究選用新西蘭兔作為實驗動物，采用前交叉韌帶橫斷法建立KOA模型。本研究結果顯示，KOA組實驗兔右肢關節活動明顯受限，關節軟骨表面可見凹陷處，HE染色顯示軟骨表層有裂隙、軟骨細胞層次不清晰、排列無序，提示KOA模型建模成功。

miRNA廣泛分布于機體中，是非編碼短鏈RNA，通過互補靶基因mRNA的3′端非編碼區的堿基，使靶基因mRNA降解或翻譯受到抑制，從而調控相關靶蛋白的表達，在人體一系列病理生理進展中發揮極其重要的作用[12]。研究表明，多種miRNA在KOA患者中表達異常。例如，血清miRNA-300表達水平隨KOA患者X線分級及Kellgren-Lawrence分級的增高而增加，可較好地反映出KOA的嚴重程度和軟骨損傷程度[13]；KOA患者滑膜中miRNA-140和miRNA-199的表達水平與KOA進展相關[14]；miRNA-140-5p通過調控Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB信號通路來保護KOA大鼠模型的滑膜[15]。miRNA-29a作為miRNA成員之一，廣泛參與甲狀腺乳頭狀癌、腸癌、肝纖維化等多種疾病的病理生理過程[16-18]。此外，miRNA-29可通過抑制信號轉導子和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制類風濕關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖并誘導其凋亡[19]，同時可靶向B細胞淋巴瘤-2相關蛋白X以調節骨關節炎軟骨細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，非干預組兔子血清miRNA-29的表達水平明顯低于空白對照組(P<0.05)，提示miRNA-29表達降低可能是KOA形成的潛在危險因素。

有研究顯示，VEGF參與多種關節炎的發生和發展[21-22]。關于SCGF-β表達水平與KOA的關系的研究雖然不多見，但在不穩定無癥狀頸動脈斑塊相關研究中，可在患者斑塊內檢測到SCGF-β，這提示SCGF-β參與局部和全身炎癥[23]。血清TNF-α和CRP水平與炎癥的發生密切相關，是衡量機體發生炎癥的重要指標。本研究結果顯示，非干預組兔子血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達水平均高于空白對照組(均P<0.05)，即KOA會導致兔子血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達水平升高，提示KOA形成的過程中會伴隨炎癥反應的發生。本研究中，利用抗SCGF-β抗體和抗VEGF抗體治療KOA模型兔子后，發現SCGF-β組和SCGF-β+VEGF組血清SCGF-β的表達水平低于VEGF組與非干預組，VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清VEGF的表達水平低于SCGF-β組與非干預組，而且SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP的表達水平均低于非干預組，SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP的表達水平均低于SCGF-β組與VEGF組(均P<0.05)，提示采用這兩種抗體中和KOA模型兔子血清中的SCGF-β或VEGF后，可抑制機體炎癥反應，且兩者聯合干預的抗炎效果更佳[24]。為驗證miRNA-29a對SCGF-β和VEGF的作用，本研究制備KOA軟骨細胞后分別轉染miRNA-29a 模擬物與抑制物，觀察兩者對KOA軟骨細胞SCGF-β和VEGF表達的影響。結果顯示，上調miRNA-29a的表達(即Mimic組)，KOA軟骨細胞的SCGF-β、VEGF的蛋白及mRNA表達水平降低；反之，下調miRNA-29a的表達(即Inhibitor組)，轉染KOA軟骨細胞的SCGF-β、VEGF的蛋白及mRNA表達水平升高。表明miRNA-29a對KOA軟骨細胞的SCGF-β和VEGF的表達具有反向調控作用，這有助于減輕KOA引起的炎癥反應，從而控制病情，但其具體機制還需進一步研究。

綜上所述，KOA兔子血清miRNA-29a的表達水平降低，血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達水平升高，下調SCGF-β和VEGF表達可抑制KOA兔子體內的炎癥反應；上調miRNA-29a表達水平可抑制KOA軟骨細胞SCGF-β、VEGF的表達，這有助于減輕KOA引起的炎癥反應，從而控制病情。