間充質干細胞治療骨性關節炎的研究進展▲

黃玉文 秦 煜 李書振

(1 廣西中醫藥大學研究生學院，南寧市 530000，電子郵箱：361216794@qq.com；2 廣西壯族自治區人民醫院骨科，南寧市 530021)

【提要】 細胞療法治療骨性關節炎療效確切且安全性較高，其中間充質干細胞作為多能基質細胞，可以從骨組織、脂肪組織、滑膜組織等多種自體和同種異體組織中分離和分化，具有減輕炎癥并促進血管生成的作用，目前已逐漸成為治療骨性關節炎的一種替代細胞療法。本文就間充質干細胞的來源、給藥途徑、最佳劑量、注射頻率對骨性關節炎患者的療效做一綜述。

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性、退行性、全關節疾病，其發病機制復雜，目前尚未徹底闡明，其特征是關節軟骨逐漸喪失，軟骨下骨和周圍軟組織受損[1]。最近的一項流行病學研究表明，美國有3 080萬人并且全世界有3億人患有OA[2]。傳統的藥物如對乙酰氨基酚、非甾體抗炎藥、阿片類藥物、皮質類固醇、透明質酸、富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)等適用于早中期OA患者的治療，膝關節置換手術(total knee arthroplasty，TKA)則常用于晚期OA患者的治療，但是目前這些治療方法均只能控制癥狀，而不能有效地修復受損的軟骨[3]。

國際細胞治療學會將人間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)定義為塑料貼壁細胞，表達CD73、CD90和CD105細胞標志物，而不表達CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45和人白細胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)等造血標志物，并能分化為成骨細胞、軟骨母細胞和脂肪細胞[4]。此外，MSC具有固有免疫調節特性，可以減輕炎癥反應，支持局部干細胞和祖細胞的生長和分化，從而促進血管生成、促進細胞存活和分化，防止局部細胞及組織纖維化[5]。MSC是目前再生醫學領域最有臨床應用前景的種子細胞，其是一種多能基質細胞，可以從骨組織、脂肪組織、滑膜組織和圍產期組織等多種自體和同種異體組織中分離和分化，已逐漸成為治療OA的一種替代細胞療法[6]。本文就MSC的來源、給藥途徑、最佳劑量、注射頻率對OA患者的療效進行綜述。

1 MSC的常見來源

1.1 骨髓來源的MSC 骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BM-MSC)是最早被人類發現的MSC，具有固有的軟骨分化潛能[7]。BM-MSC通常取自髂后上棘里的骨髓濃縮物，骨髓濃縮物還含有造血干細胞、內皮祖細胞以及相關的細胞因子和生長因子[8]。Mianehsaz等[9]總結了各種外泌體在OA中的致病作用，提出BM-MSC的外泌體可作為一種無細胞治療OA和關節損傷的新方法。Liu等[10]通過定量研究軟骨細胞增殖、遷移、軟骨基質形成和軟骨細胞基因表達，發現Kartogenin(BM-MSC的一種小分子化合物)的外泌體比BM-MSC的外泌體在促進軟骨修復方面表現更加優異。最近，關于細胞再生過程是通過移植的MSC自身分化，或是通過其在宿主細胞上的內分泌及旁分泌作用，或者兩者兼而有之而引起爭論[11]。有研究發現，外源性BM-MSC可在損傷的軟骨細胞中分泌可溶性生長因子和細胞因子，這些因子對OA及類風濕性關節炎患者自身形成新組織的干細胞具有免疫調節、抗炎和營養(再生)作用[12]。然而，基于BM-MSC的臨床試驗中，骨髓中分離的MSC數量非常少，只有0.001%～0.01%[13]。此外，BM-MSC的再生能力還與供體的健康狀況和年齡有關，供體年齡越大，BM-MSC在體外的增殖和分化潛能越弱，并且在某些情況下還會出現促進炎癥進展的情況[14]。因此，雖然BM-MSC在軟骨修復方面的研究已取得較大進展,但仍存在以上各種問題,還需要更多的臨床試驗研究來確定其最佳效果。

1.2 脂肪來源的MSC 脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，AD-MSC)是一類來源于脂肪組織的MSC，與BM-MSC相比，AD-MSC的優勢在于其提取分離得到的MSC的比例更高(約5.0%)，并且具有侵入性較小、患者依從性較高、成本較低等優點[15]。AD-MSC對OA軟骨細胞具有旁分泌作用，可促進巨噬細胞和T細胞的產生，通過降低炎癥標志物表達水平，改善患者臨床癥狀，同時，可在一定程度上促進軟骨的再生[16]；此外，AD-MSC與BM-MSC相比具有更高的增殖分化潛力[17]。但是，AD-MSC的增殖分化潛力在很大程度上取決于產生脂肪組織的部位。Tang等[18]分別對小鼠和人的皮下和內臟脂肪組織進行AD-MSC的分離,并分析皮下或內臟脂肪組織的AD-MSC是否對OA具有同樣的改善作用，結果表明內臟脂肪組織來源的AD-MSC增殖能力明顯高于皮下脂肪組織來源的AD-MSC，但皮下脂肪組織來源的AD-MSC在體外具有更好的軟骨分化潛能和免疫抑制作用。臨床上在TKA術后通常切除髕上脂肪墊(suprapatellar fat pad，SPFP)和髕下脂肪墊(infrapatellar fat pad，IPFP)分離自體AD-MSC。Muoz-Criado等[19]將TKA術后患者的SPFP和IPFP經過體外培養分化后的AD-MSC分別移植到嚴重OA的小鼠模型中，發現SPFP來源的AD-MSC表現出更高的成骨和軟骨形成率，可顯著減輕OA模型小鼠的膝關節炎癥和軟骨退變程度，增加了糖胺聚糖的產生，并誘導了內源性軟骨的生成。因此，AD-MSC的使用可能有利于OA的治療，但未來仍需要大量的實驗研究來證明其有效性。

1.3 滑膜來源的MSC 滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cell，SMSC)來源于關節腔內的滑膜組織。研究表明，SMSC可以從髖關節中分離，而從膝關節分離出來的SMSC顯示出更好的軟骨形成潛力[20]。SMSC可以保存在4℃或13℃的人血清中，而不會顯著影響其生存能力和軟骨形成潛力[21]。從OA患者中分離出的SMSC被證明是一種有效的替代細胞來源，可用于基于組織工程構建的軟骨缺損治療[22]。研究發現，來自SMSC-140s的外泌體可促進軟骨形成，而不影響細胞外基質的分泌[23]。You等[24]發現，長鏈非編碼RNA母系印記基因3通過組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶介導的組蛋白3上的第27位賴氨酸的三甲基化抑制Tribbles同源蛋白2表達來調控SMSC向軟骨分化。此外，有研究發現白細胞介素1β預處理SMSC可增強其軟骨形成潛力[25]。在半月板撕裂模型豬實驗中，SMSC已被證明能夠增強無血管區縱向撕裂半月板的修復能力[26]。Hatsushika等[27]的研究也證明了在切除內側半月板的豬膝關節內注射SMSC能夠使其關節軟骨再生。因此，體外及動物實驗證實SMSC具有較強大的軟骨再生能力，然而其具體療效還需要更多的人體試驗加以證實。

1.4 圍產期來源的MSC 圍產期組織主要包括臍帶血、臍帶、胎盤等，這些組織在分娩后通常作為生物廢物被丟棄，不存在倫理和道德問題，這使得它們成為MSC更理想的來源[28]。臍帶血由造血干細胞、內皮祖細胞和MSC組成。與骨髓相似，臍帶血中MSC的數量極低，很難從臍帶血中分離出MSC[29]。研究發現，臍帶血間充質干細胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell，UCB-MSC)的增殖潛力與胎齡有關， UCB-MSC在胎兒足月時的生長速度明顯降低[30]。但是最近的一項研究表明，UCB-MSC比成人來源的MSC具有更強的軟骨分化和成骨分化潛能[31]。除了臍帶血,臍帶也被廣泛用于MSC的分離。整個臍帶分為三段，每段長3 cm，分別為母體段、中間段和胎兒段，而人臍帶母體段來源的MSC是同種異體骨再生的理想細胞[32]。研究發現，臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，UC-MSC)與BM-MSC比較其增殖率顯示出更快的倍增時間和更強的傳代能力[33]。在成骨分化方面，UC-MSC顯示出更強的分化潛能，與BM-MSC相比，UC-MSC所表達的成骨基因1型膠原是其兩倍；此外，UC-MSC所表達的軟骨性基因Y-box 9和成骨基因2型膠原是BM-MSC的50倍[34]。然而，許多因素如妊娠年齡、分娩途徑、產婦年齡、妊娠糖尿病和子癇前期等都會影響圍產期來源的MSC的增殖和分化潛能[35]。圍產期來源的MSC作為一種新的替代細胞來源，在軟骨分化及基因治療中有著廣闊的應用前景。

2 MSC治療OA的給藥途徑

目前大多數動物模型和臨床試驗中，MSC的給藥途徑都是關節腔內直接注射，而沒有使用任何支架載體。關節腔內直接注射的優點是簡單易行，同時可以避免在TKA手術過程中可能產生的副作用[36]。然而Kim等[37]的薈萃分析提示，關節腔內注射MSC可能不再是促進OA軟骨再生的唯一理想途徑，因為只有少于5%的被移植細胞在注射后幾天內留在應用部位。Munar等[38]對50例通過關節腔注射自體MSC的OA患者進行評估,發現有10例患者的軟骨質量沒有變化，3例患者的軟骨質量出現惡化，出現這種情況的原因是注射過程中細胞懸液泄漏和操作過程中造成的細胞損傷，從而降低了MSC的存活率[39]。因此，提高MSC活細胞植入率對于MSC治療OA的療效至關重要。隨著組織工程技術的不斷發展，增強細胞生物學能力的支架載體的應用將有助于提高細胞治療的療效[40]。基于支架載體的方法是通過使用物理力學結構作為細胞培養的底物，從而簡化了細胞組織形態的發生過程，它允許產生相對較大尺寸的工程化組織，而水凝膠是最受歡迎的支架系統之一，因為其可為MSC提供高度水合的3D環境，不僅保護細胞并有助于將它們保持在適當的位置，促進軟骨再生和透明軟骨形成[41]。Brunelle等[42]開發了一種混合支架系統，它將熱敏性水凝膠聚乙二醇-聚N-異丙基丙烯酰胺與可生物降解聚己內酯結合在一起，形成復合的微纖維結構，混合支架改善了細胞/支架結構的力學性能，同時促進了MSC向軟骨細胞的分化。雖然水凝膠在干細胞治療中取得顯著的進展，但隨著新的合成和加工技術的發展，水凝膠的設計也在不斷變化。因此，在未來選擇何種水凝膠應用于干細胞治療OA患者將是主要挑戰之一。

3 MSC治療OA的最佳劑量

目前MSC治療OA的最佳劑量尚無統一標準，大多數的臨床試驗中MSC的劑量范圍為1.18～150×106個/kg[43-44]。Koh等[43]給予18例OA患者關節腔內注射1.18×106個/kg AD-MSC+3.0 mL PRP，并隨訪26個月，發現患者的西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數、Lysholm評分和視覺模擬量表評分均有明顯改善。Pers等[45]發現，OA患者膝關節腔內注射低劑量(2×106個/kg) 自體AD-MSC后，患者的疼痛感和膝關節功能較中劑量(10×106個/kg)和高劑量(50×106個/kg)均有不同程度的改善。Gupta等[44]的研究也表明，采用低劑量(25×106個/kg)同種異體BM-MSC關節腔注射治療OA患者，較其他劑量(50×106個/kg、75×106個/kg和150×106個/kg)更能改善患者的疼痛和膝關節功能。但是Jo等[46]給OA患者注射不同劑量的MSC，隨訪兩年后發現最高劑量組(100×106個/kg)與較低劑量組(10×106個/kg和50×106個/kg)相比，患者的疼痛感和膝關節功能均有顯著改善。Kabat等[47]分析了2004～2018年報告的914項MSC試驗，建議MSC的有效低劑量為75×106個/kg，MSC預期有效劑量為150×106個/kg，以及MSC較高劑量為300×106個/kg。然而，MSC治療OA的最佳劑量還需要更多的隨機對照臨床研究來確定。

4 MSC治療OA的給藥頻率

目前大多數的研究都只使用單劑量的MSC治療OA患者，并對患者進行標準的6個月隨訪，在這一時間框架內并不能充分觀察MSC治療OA的長期副作用或長期臨床價值。由于關節腔注射的MSC在關節內的活性持續時間有限，單次關節腔內注射MSC不再被認為是“終生OA治療”，多次關節腔內注射在一定程度上有更好的效果[48]。Matas等[49]對單次和多次(首次治療后6個月再次使用MSC)使用MSC治療OA患者的療效進行評估，發現多次使用MSC治療的患者的疼痛程度明顯低于單次使用MSC治療的患者，安全性較高，并未出現不良反應。Shah等[50]的研究也得出相同的結論。Magri等[51]將28匹OA模型馬分成兩組，MSC-1組注射MSC后1個月注射安慰劑，MSC-2組注射MSC后1個月再次注射MSC，發現兩組馬匹的臨床總評分均較治療前有明顯改善，但是兩組的臨床總評分差異無統計學意義。因此，MSC治療OA的給藥頻率還需要更多的對照研究才能得出明確的結論。

5 小 結

盡管目前仍缺乏MSC治療OA長期療效的直接證據，但MSC用于治療OA已經成為一種有效的潛在方法。然而目前的臨床實驗研究對于MSC的細胞組織來源、劑量、注射次數、細胞培養方法、移植方式、隨訪時間及用于評估改善情況的方法均沒有統一的標準，其細胞最佳來源仍然還處在驗證階段。因此，在未來的臨床研究中仍需確定MSC的作用機制、最佳來源、最佳細胞劑量、理想的目標患者群體以及最佳的給藥方法。總而言之，在未來MSC治療OA將擁有更加廣闊的應用前景。