耐鹽脅迫菜豆品種篩選及其苗期耐性生理研究

李夢娣 馮國軍 楊曉旭 劉 暢 閆志山 劉大軍*

（1 黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150081；2 黑龍江大學現代農業與生態環境學院，黑龍江哈爾濱 150081）

我國存在大量鹽堿地，耕地中鹽漬化面積達到920.9 萬hm，約占全國土地面積的1/10（張曉婷等，2021）。近十幾年來，隨著人們對反季節蔬菜需求的增大，設施蔬菜的栽培面積迅速擴大，由于設施栽培采用特殊的覆蓋結構，完全改變了作物生長的內部生態環境及自然狀態下的水熱平衡，并且伴隨著肥料的施用，極大改變了土壤的理化性質，使設施土壤次生鹽漬化的程度越來越高。次生鹽漬化現已成為設施作物栽培的主要問題之一（Li et al.，2007；Shen et al.，2016）。當土壤發生次生鹽害后，一方面影響土壤結構，使土壤變得更加板結；另一方面影響蔬菜的生長發育，最終降低產量和品質（張鳳銀 等，2018）。

菜豆（L.）原產于中南美洲（Bitocchi et al.，2012），有著豐富的營養價值（馮國軍和劉大軍，2016），在全世界范圍內有著廣泛的種植，是重要的蔬菜作物。近年來隨著人們生活水平的提高，菜豆的設施栽培面積也在增加（羅萱等，2015），土壤次生鹽漬化問題更加嚴峻。前人已經對小麥（Rani et al.，2018）、玉米（賈丹莉 等，2016）、番茄（王毅 等，2014）等多種作物進行了鹽脅迫下的品種篩選，篩選出了優質的種質資源，但還未見菜豆耐鹽種質資源篩選的相關研究報道。目前對抵抗鹽脅迫的作物種質資源篩選主要集中在萌發期（余慶輝 等，2010）以及苗期，而在生產實踐中，可以通過先育苗后移栽的方式減輕鹽分對作物萌發期的影響，因此本試驗主要探究菜豆苗期鹽脅迫下的品種篩選。

鹽堿土以土壤溶液中Na、Mg、Ca、CO、HCO、Cl和SO2濃度高為主要特征（劉愛平，2007），尤其是Na和Cl含量高，植物鹽脅迫至今多以中性鹽NaCl 為研究對象（石德成和趙可夫，1997），故本試驗亦使用NaCl 模擬鹽脅迫。植物的抗鹽堿性是由多種基因控制的（閆晶秋子 等，2019），這些基因相互作用形成復雜的性狀，采用單一指標研究植物的抗鹽堿性具有局限性（田藝心 等，2020），使用加權隸屬函數，通過對隸屬函數的D 值進行聚類分析，可以更好地評價植物的耐鹽性。加權隸屬函數和聚類分析的方法已被用于谷子（韓飛 等，2018）、大豆（曹帥，2020）、高粱（袁闖 等，2019）等多種植物品種篩選，并篩選出了一批優秀的耐鹽品種。不同的菜豆品種對鹽脅迫的耐受程度不同，為了更好地選出最適合的NaCl 濃度進行后續的品種篩選，本試驗采用營養液水培的方法，選取生產實踐中抗逆性不同的4 個品種，在苗期使用0、50、100、150、200 mmol·L的NaCl 進行鹽處理，篩選出最能體現品種間差異的NaCl 濃度，然后利用該NaCl 濃度，采用隸屬函數法對40 個菜豆品種進行綜合評價，隨后對隸屬函數值進行聚類分析，以期篩選出高耐鹽菜豆品種，為菜豆耐鹽育種提供理論依據，最后對篩選出的高耐鹽品種和極敏感品種進行生理指標測定，探究其應對鹽脅迫的不同方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年1—4 月在黑龍江大學農藝與種業團隊實驗室進行。41 個供試菜豆品種來自黑龍江大學園藝學團隊種質資源庫（表1）。

表1 參試品種名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽濃度確定 選取抗逆性不同的4 個菜豆品種青冠、P16071、P16156、熱那亞于1 月5 日播種，首先使用蛭石為基質將菜豆播種于72 孔穴盤中，置于培養架上12 h 光照、12 h 黑暗培養。待幼苗長至兩葉一心后，每個品種選取長勢均勻一致的幼苗，將幼苗的根系置于清水中洗去附著在根系上的蛭石移栽至水培（營養液配方為黑龍江大學園藝學團隊提供）裝置中，12 h 光照、12 h 黑暗培養，緩苗2 d 后對幼苗進行鹽濃度分別為0、50、100、150、200 mmol·L的NaCl 處理，每個處理3 次重復，每個重復4 株幼苗，以0 mmol·L的NaCl處理為對照。

1.2.2 鹽脅迫下的品種篩選 將40 個菜豆品種穴盤基質育苗后進行水培處理，水培方法同1.2.1，向處理組幼苗的營養液中添加上一步確定后的NaCl濃度，對照組為非鹽脅迫組，篩選耐鹽脅迫的菜豆品種。

1.3 試驗指標測定

1.3.1 農藝性狀 鹽脅迫處理前對各品種幼苗進行整株稱重記為初始鮮質量，處理5 d 后對幼苗進行整株稱重記為5 d 后鮮質量，計算生長量。測量植株頂端到子葉節的距離記為株高，選取第1 片三出復葉進行掃描，使用IC Measure 2.0.0 133 軟件測量葉面積。最后將植株在子葉節部位分開，上半部分和下半部分別記為地上部和地下部，將其分別裝入信封中105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后稱量即為地上部、地下部干質量，計算根冠比。以上每個處理進行3 次重復，每個重復1 株。

生長量=（W-W）/W

式中W為初始鮮質量，W為處理5 d 后鮮質量。

根冠比=地下部干質量/地上部干質量

1.3.2 光合指標 鹽脅迫處理1 d 后，使用LI-6400 便攜式光合儀（Li-Cor Inc，USA）隨機選取處理組和對照組健康無破損真葉進行凈光合速率測定，每個處理進行3 次重復，每個重復為1 片真葉，每個葉片測量3 次取平均值。

1.3.3 生理指標 為了進一步探究鹽脅迫對高耐鹽品種和鹽極敏感品種的影響，在處理3 d 后對鹽脅迫下的處理組及非鹽脅迫下的對照組的真葉進行采樣，每個處理3 次重復，每個重復0.5 g，進行SOD、POD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量測定（李合生，2000）。

1.4 數據處理

為減少各品種間固有差異，對所有數據采用均值處理，統計時依據公式（鑒定指標相對值=脅迫下指標值/對照指標值）計算相對生長量、相對根冠比、相對株高、相對葉面積、相對凈光合速率。以供試品種各鑒定指標為依據，耐鹽性評價應用模糊數學中的加權隸屬函數法對40 個菜豆品種進行綜合評價，并根據加權隸屬函數值（D 值）進行系統聚類分析。計算公式（陳新 等，2014）如下：

式中，μ（X）為各i 材料基于鑒定指標j 的隸屬函數值；X、X分別為供試材料中指標的最大值、最小值；X表示i 種類j 指標的測定值；CV為各供試材料μ（X）的變異系數；W為權重，表示CV在總變異中所占比率；D 表示菜豆品種耐鹽性綜合評價值。

1.5 數據分析

利用Excel 2019 軟件整理試驗數據并進行圖表繪制，使用SPSS Statistics 26.0 軟件進行相關性分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鹽濃度的確定

隨著NaCl 濃度的增加，4 個菜豆品種的根冠比有上升的趨勢，而生長量和株高則呈現明顯的下降趨勢（圖1～3）。在NaCl 濃度為150～200 mmol·L時，隨著鹽濃度的增加，除青冠外其余3 個品種的根冠比變化明顯趨緩；除P16156 外，其他品種生長量基本沒有變化；P16165 和熱那亞的株高基本停止變化，而青冠和P16071 的株高仍繼續降低。表明當NaCl 濃度為150 mmol·L時，在保證絕大多數品種指標一致的同時更能體現出個別品種的耐鹽差異程度，各項指標品種間的變異系數也在NaCl 濃度為150 mmol·L時最大（表2）。在NaCl 濃度為200 mmol·L時幾乎所有的植株在鹽脅迫后都會立刻枯萎，因此選擇150 mmol·L的NaCl 濃度為最適宜進行耐鹽品種篩選的鹽濃度進行后續試驗。

表2 4 個菜豆品種受到不同濃度鹽脅迫后相對生長量、相對株高、相對根冠比及各指標變異系數

圖1 鹽脅迫5 d 后4 個菜豆品種在不同鹽濃度下的根冠比

2.2 40 個菜豆品種耐鹽能力分析

2.2.1 各指標變異系數 各指標的變異系數顯示（表3），相對生長量的變異系數最大值為P19006的522.22%，最小值為P18045 的-328.69%；相對根冠比變異系數最大值為P18051 的27.19%，最小值為P16203-16 的0.04%；相對葉面積和相對凈光合速率變異系數的最大值分別為P19030 的58.14%和P19006 的88.37%，最小值分別為P19002 的5.41%和P18051 的7.53%；各項指標的變異系數最大值和最小值相差均較大。

表3 40 個菜豆品種各指標的變異系數

續表

圖2 鹽脅迫5 d 后4 個菜豆品種在不同鹽濃度下的生長量

圖3 鹽脅迫5 d 后4 個菜豆品種在不同鹽濃度下的株高

2.2.2 各指標權重 對各項指標的隸屬函數值分析表明（表4），隸屬函數平均值（μ）最大的為相對生長量0.69，最小的為相對株高0.25，隸屬函數值代表著菜豆苗期鹽脅迫指標敏感程度：相對生長量＞相對凈光合速率＞相對根冠比＞相對葉面積＞相對株高，相對生長量、相對根冠比、相對株高、相對葉面積和相對凈光合速率指標的權重分別為0.08、0.24、0.25、0.24 和0.18。

表4 40 份菜豆種質基于5 種耐鹽指標的隸屬函數值

2.2.3 各指標與D 值相關性分析 相關性分析表明（表5），除相對株高外其他各項指標均與D 值呈極顯著正相關，表明相對生長量、相對根冠比、相對葉面積、相對凈光合速率均與菜豆耐鹽能力密切相關。相對凈光合速率和相對根冠比、相對葉面積和相對生長量呈極顯著正相關。

表5 各指標與D 值的相關性

2.2.4 基于D 值對各品種進行系統聚類分析 對40 個菜豆品種基于5 個耐鹽指標的隸屬函數值進行聚類分析，結果如圖4 所示，將40 個菜豆品種分為5 大類：Ⅰ類，高耐鹽，包括P16152、P19023、P18009、P18012、P18051；Ⅱ類，耐鹽，包括P18039、P16079、P16156、P18017、P16024-8、P19002、P18014；Ⅲ類，較耐鹽，包括P16203-16、P19024、哈優三、P16314、熱那亞、A24-4、P16038、P18069、P16071、P16030、P16157、P18002、P16009；Ⅳ類，鹽敏感，包括P19011、P18045、P18084、P18037、P16133、P18016、P19006、P16070、P18041、哈菜豆；Ⅴ類，鹽極敏感，包括A18、P16158、P16028、P16333、P19030。鹽極敏感和高耐鹽各有5 個品種，數據呈現兩頭品種少、中間品種多的特點，符合正態分布。

圖4 40 個菜豆品種的D 值聚類分析結果

2.3 鹽脅迫對不同菜豆品種SOD、POD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量的影響

為了進一步探究鹽脅迫對高耐鹽品種和鹽極敏感品種的影響，對5 個高耐鹽品種和5 個鹽極敏感品種進行SOD、POD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量測定（圖5、6、7、8）。如圖5 所示，SOD 活性測定結果顯示多數品種在受到鹽脅迫后SOD 活性均上升，有5 個品種SOD 活性極顯著升高，且5 個品種中僅有1 個為高耐鹽品種。POD活性測定結果顯示（圖6），在受到鹽脅迫后各品種的POD 活性均極顯著上升。受到鹽脅迫后各品種活性氧生成速率均有不同程度的上升（圖7），但僅有5 個品種活性氧生成速率極顯著上升，1 個品種顯著上升，其中4 個極顯著上升品種為鹽極敏感品種，其余2 個為高耐鹽品種。MDA 含量與活性氧生成速率相似（圖8），受到鹽脅迫后僅有2個差異極顯著品種和2 個差異顯著品種，僅有1 個差異顯著品種為高耐鹽品種，其余為鹽極敏感品種。

圖5 鹽脅迫3 d 后5 個高耐鹽品種及5 個鹽極敏感品種SOD 活性

圖6 鹽脅迫3 d 后5 個高耐鹽品種及5 個鹽極敏感品種POD 活性

圖7 鹽脅迫3 d 后5 個高耐鹽品種及5 個鹽極敏感品種活性氧生成速率

圖8 鹽脅迫3 d 后5 個高耐鹽品種及5 個鹽極敏感品種MDA 含量

3 討論

鹽脅迫會對植物的生長造成嚴重影響，相較于萌發期，絕大多數作物苗期對鹽脅迫的耐受能力更強（李彥 等，2008）。生產實踐中已有多種作物采取先育苗后移栽的方式提高作物抵抗鹽脅迫的能力（潘天遵 等，2021），因此，菜豆苗期耐鹽能力的強弱對于生產實踐具有重要意義。為了更好地描述供試材料間耐鹽性的相對差異，前人多通過聚類分析的方式將綜合評價的D 值進行聚類，從而將供試材料分為幾個大類，如：田藝心等（2020）按耐鹽性強弱將30 個菜豆品種分為強耐鹽品種、耐鹽品種、中等耐鹽品種、鹽敏感型品種和不耐鹽品種5 個大類，馬榮（2016）將24 個向日葵品種分為強耐鹽堿性品種、中度耐鹽堿性品種和鹽堿敏感型品種3 大類，本試驗將40 個菜豆品種耐鹽性分為高耐鹽、耐鹽、較耐鹽、鹽敏感、鹽極敏感5 大類，可為其耐鹽育種及機理研究提供基礎研究材料。

有研究表明花青素可以提高植物抵抗低溫、滲透脅迫、光脅迫等多種脅迫的能力（Merzlyak & Chivkunova，2000；Khavari-Nejad et al.，2006；Meng et al.，2014）。而花青素含量的多少主要表現為植株的紫化程度（李燕，2016；李潘，2020），在本試驗中共有6 個紫化品種，所有紫化植株均表現為莖紫化，其中高耐鹽品種2 個，鹽敏感品種3個，鹽極敏感品種1 個，沒有耐鹽和較耐鹽品種，出現了一定的兩級分化，表明本試驗中菜豆品種的花青素含量并不是影響菜豆耐鹽性的主要原因。

受到鹽脅迫后植物會啟動多種機制從而減緩脅迫對植株的不利影響，植物在逆境條件下出現的傷害或對逆境的不同抵抗力往往與體內保護酶活性有關（王玉鳳 等，2021），其中SOD 和POD 是防御活性氧及其他自由基對細胞膜系統造成傷害的更為重要的酶（李彥 等，2008），本試驗中鹽脅迫下SOD 活性在5 個鹽極敏感品種中的4 個品種中顯著提高，而在高耐鹽品種中僅有1 個品種SOD活性顯著提高，這與前人在向日葵（凌云鶴 等，2019）、高梁（高玉坤 等，2020）等植物鹽脅迫后所有品種的SOD 含量均顯著上升不同，推測可能是由于不同品種菜豆對150 mmol·L這一鹽濃度的響應不同，進而導致高耐鹽和鹽極敏感品種之間的差異。除了不同品種對鹽濃度的響應不同外，不同采樣時間也可能導致這個結果，如陳桂平等（2021）在無花果上的研究，6 個不同無花果品種在鹽脅迫0、6、12、24、48 h 等5 個采樣時間SOD 活性呈現不同的變化趨勢。

與鹽脅迫下SOD 活性不同的是，本試驗中所有品種鹽脅迫后POD 活性均極顯著提高，這與王振華等（2020）的研究結果相似。鹽脅迫下植物體內產生大量活性氧自由基，對細胞膜脂造成直接損傷，MDA 是膜脂過氧化的主要產物，可衡量膜損傷程度的大小（嚴琳玲 等，2021），本試驗中在受到鹽脅迫后多個品種的活性氧生成速率和MDA 含量均有所升高，鹽極敏感品種在這2 個指標上有顯著升高變化的品種個數多于高耐鹽品種，表明高耐鹽品種在鹽脅迫下清除組織中活性氧的能力更強，膜脂過氧化程度更小。

除POD 活性在高耐鹽品種和鹽極敏感品種中都有顯著提高外，SOD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量在鹽極敏感品種中的顯著差異品種數量明顯多于高耐鹽品種，這也側面驗證了本試驗品種篩選的結果。

4 結論

150 mmol·LNaCl 濃度為最適宜的耐鹽菜豆品種篩選濃度。40個菜豆品種可分為高耐鹽、耐鹽、較耐鹽、鹽敏感、鹽極敏感5 類，其中P16152、P19023、P18009、P18012、P18051 為高耐鹽品種，A18、P16158、P16028、P16333、P19030 為鹽極敏感品種。對高耐鹽品種和鹽極敏感品種的生理指標測定結果表明，鹽脅迫下除POD 活性外，SOD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量在鹽脅迫下鹽極敏感型品種中差異顯著的品種數量均高于高耐鹽品種，SOD 活性、活性氧生成速率和MDA 含量相較于POD 活性更適合評價菜豆耐鹽性。