不同甘藍類蔬菜材料對根腫病的抗性鑒定及分子標記輔助選擇

蔣順順 劉才銘 趙 宇 胡文惠 吳嘉炳 李勤菲 任雪松 宋洪元 司 軍

（西南大學園藝園林學院，重慶市蔬菜學重點實驗室，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715）

根腫病是由蕓薹根腫菌（Woron.）侵染引起的土傳性病害，主要在十字花科植物之間傳播，被侵染的植株根部會出現腫瘤，十字花科植物都有被侵染的可能（彭琦 等，2019）。根腫病最早發現于地中海西岸和歐洲南部，目前全世界均有分布（費維新 等，2016）。我國20 多個省、市、自治區均有十字花科蔬菜根腫病發生，西南地區和中部地區發病最為嚴重，一般產量損失20%～30%（張紅 等，2021）。近年來，隨著蔬菜種植面積逐年擴大，商品種子的相互調運，致使我國蔬菜根腫病的發病面積逐年擴大，嚴重危害了十字花科蔬菜生產（王靖 等，2011）。植株被根腫菌侵染后，根部腫大，阻礙水分和營養物質的運輸導致地上部分枯萎，嚴重時可導致全株死亡（伍文憲 等，2015）。根腫菌的休眠孢子在土壤中可以存活十余年之久，并且可以借由農事活動或以風、水為媒介進行傳播（馬淑青 等，2006）。在眾多根腫病防治措施中，選育抗病品種是最經濟有效的措施，因此現在全球范圍內都在大力開展抗根腫病育種工作。但由于甘藍類蔬菜抗根腫病資源比較缺乏，且根腫菌生理小種較多，因此抗根腫病育種進程緩慢。

對育種材料進行抗性鑒定是抗病育種的基礎，張小麗等（2016）對446 份青花菜材料進行根腫病抗性鑒定，其中1.12%表現為抗病。黃蓉等（2019）對291 個油菜品種進行根腫病抗性鑒定，其中9 號生理小種侵染的所有品種均未感病，4 號生理小種侵染的有5.26%的品種表現抗病。司軍等（2009）對19 份甘藍材料進行根腫病抗性鑒定，篩選到3 份抗病材料。甘彩霞等（2017）對100 份蘿卜種質進行根腫病抗性鑒定，抗病種質占13%，包括8 份白皮蘿卜、3 份紅皮蘿卜和2 份綠皮蘿卜。在根腫病抗性鑒定的過程中，為了保證發病情況穩定一致，通常采取人工接種的方法進行鑒定，目前普遍采用的人工接種方法有菌土法（司軍 等，2003）、蘸根法（Johnston，1968）和灌根法（朱紅芳 等，2016）。菌土法和蘸根法操作較為繁瑣、耗時，不適合大量材料的篩選鑒定；灌根法操作簡便，發病穩定，被廣泛應用于根腫病抗性鑒定。

利用根腫病抗性基因進行新品種選育是抗根腫病育種必不可少的工作內容。目前已經報道了8 個大白菜上的根腫病抗性基因，分別為、、、、、、和，這些基因都已被定位在大白菜染色體上，且均為單基因顯性 遺 傳（Suwabe et al.，2003；Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008）。Kato 等（2013）研究表明，位于標記KB59N07 和B1005之間的CRb基因與SSR 標記B0902 緊密連鎖，從而能夠輔助選擇十字花科作物對根腫病的抗性。西南大學十字花科蔬菜研究所根據先正達（中國）投資有限公司專利公布的與甘藍根腫病抗性基因相關的RAPD 標記，進行PCR 擴增，對特異條帶進行回收、克隆后，成功將RAPD 標記轉化為SCAR 標記（OA）（何海艷，2018），并利用SCAR標記對不同抗、感根腫病甘藍材料進行分子標記鑒定，與人工接種根腫病抗性鑒定結果表現一致（宋瑩 等，2019）。因此，可以利用人工接種抗性鑒定結合分子標記輔助選擇增強對根腫病抗性鑒定結果的準確性。

本試驗采用灌根法人工接種根腫菌4 號生理小種，對西南大學十字花科蔬菜研究所提供的29 份甘藍類蔬菜材料進行根腫病抗性鑒定；并利用SSR標記（B0902）和SCAR 標記（OA）進行分子標記輔助選擇，驗證人工接種抗病性鑒定的準確性。旨在篩選抗病和耐病的甘藍類蔬菜材料，為十字花科蔬菜抗根腫病育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試29 份甘藍類蔬菜材料由西南大學十字花科蔬菜研究所提供，其種類、熟性、來源及育性詳見表1；以西園4 號為感病對照。

表1 供試甘藍類蔬菜材料的種類、熟性、來源及育性

供試根腫菌采集于重慶市武隆區發病的甘藍腫根，經Williams 鑒別系統鑒定為4 號生理小種；用自來水把甘藍腫根表面雜質清洗干凈，于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 人工接種抗病性鑒定

1.2.1 菌液的制備 取備用甘藍腫根40 g，加去離子水200 mL，攪拌機搗碎后用3 層紗布過濾，將濾液稀釋至1 000 mL；取1 mL 孢子懸浮液，稀釋10 倍，用血球計數板統計休眠孢子濃度，將休眠孢子懸浮液稀釋至2 × 10個·mL，4 ℃冰箱保存備用（張紅 等，2016）。

1.2.2 接種 2020 年10 月5 日，將29 份甘藍類蔬菜材料及感病對照在西南大學溫室內分別播種，采用50 孔穴盤基質（草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1）育苗；播種后每3 d 澆1 次水，出苗14 d后進行間苗；之后每2 d 澆1 次水，每7 d 噴施2次營養液，溫室內溫度保持25 ℃左右；3 次重復，每重復10 株。10 月26 日、幼苗兩葉一心時，將制備好的根腫菌休眠孢子懸浮液稀釋5 倍，用移液槍吸取根腫菌休眠孢子懸浮液5 mL，注射在幼苗根部；之后正常管理，注意預防蚜蟲、白粉虱等蟲害，陰雨連綿天氣適當補充光照。

1.2.3 根腫病病情調查 接種42 d 后調查根腫病發病情況。根腫病分級標準采用陳靜等（2016）的方法：0 級，根系生長正常，無腫瘤；1 級，主根不發病，部分側根或須根上有較小腫瘤；2 級，主根發病較輕，輕微膨大，部分側根或須根有腫瘤，或者主根不發病，較多側根或須根有明顯腫瘤；3 級，主根發病較重，異常膨大、龜裂，有明顯側根或須根；4 級，根系幾乎無側根或須根，主根異常膨大、龜裂或者腐爛。

發病率=（發病株數/調查總株數）× 100%

病情指數（DI）=Σ（各級病株數×相應級值）／（調查總株數×最高級值）× 100

群體抗性分級標準采用司軍等（2003）的方法：免疫（I），病情指數=0；高抗（HR），0 ＜病情指數≤5；抗病（R），5 ＜病情指數≤20；耐病（T），20 ＜病情指數≤30；感病（S），病情指數＞30。

1.3 分子標記鑒定

1.3.1 DNA 的提取 采集人工接種抗病性鑒定表現抗病和耐病的甘藍類蔬菜材料的幼嫩葉片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray &Thompson，1980）提取單株DNA 作為模板進行PCR 反應，利用Nanodrop 2000 分光光度計測定DNA 濃度。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 本試驗采用的SCAR 標記引物為OA（何海艷，2018），其引物序列見表2。PCR 反應體系為25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最 后加ddHO 補齊至25 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，7 個循環；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，22 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 本試驗采用的SSR 標記引物為B0902（沈舒，2019），其引物序列見表2。PCR 反應體系為25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最后加ddHO 補齊至25 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

表2 OA 和B0902 引物序列

2 結果與分析

2.1 人工接種抗病性鑒定

從表3 可以看出，感病對照西園4 號100%發病，病情指數為67.71，抗性分級為感病，說明本試驗采用的接種方法準確可靠。參試的29 份材料中，Cr7 表現免疫，綠抗9 號和青蓮甘藍表現高抗，S148、Cr5、Cr6 表現抗病，S146 和S296 表現耐病，其余材料表現為感病。

表3 29 份甘藍類蔬菜材料人工接種抗病性鑒定結果

2.2 分子標記鑒定

對人工接種抗病性鑒定表現免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘藍類蔬菜材料進行分子標記鑒定。

瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1 所示，Cr5、綠抗9 號、青蓮甘藍、S296 等4 份材料擴增出大小為500 bp 的特異條帶，而Cr6、Cr7、S148、S146沒有擴增出特異條帶。由此可以判斷Cr5、綠抗9號、青蓮甘藍、S296 攜帶抗病基因。

圖1 OA 對8 份甘藍類蔬菜材料的PCR 擴增結果

聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖2 所示，8 份材料都擴增出大小為180 bp 的特異條帶，由此可以判斷這8 份材料都攜帶抗病基因CRb。

圖2 B0902 對8 份甘藍類蔬菜材料的PCR 擴增結果

3 結論與討論

十字花科植物的根腫病危害近年來呈擴大趨勢，然而目前甘藍類蔬菜抗病資源缺乏，在根腫病防控方面，傳統的化學、生物和農業防治措施效果欠佳。因此，選育抗根腫病品種是最有效的途徑，而篩選鑒定抗病材料是抗病育種的基礎。肖崇剛和郭向華（2002）、孫超等（2016）通過苗期人工接種抗性鑒定，篩選出不同抗性的甘藍材料，可應用到抗病育種中。本試驗從29 份甘藍類蔬菜材料中篩選出8 份抗根腫病材料，為甘藍類蔬菜抗根腫病育種奠定了基礎。

甘藍類蔬菜抗根腫病材料的人工接種鑒定易受環境影響、費時費力，選擇準確性不夠高，采取分子標記輔助選擇可大大減少鑒定的工作量，明顯縮短育種進程，加快新品種選育。戰宗祥等（2015）運用分子標記輔助選擇成功選育了具有根腫病抗性的甘藍型油菜新品種華雙5 號；李倩等（2021）利用分子標記輔助選擇培育了抗根腫病甘藍型油菜新品種華油雜62R；徐學忠等（2015）利用分子標記輔助選擇培育了抗根腫病大白菜新品種CCR11242。在十字花科作物抗根腫病育種中，利用分子標記輔助選擇多在甘藍型油菜和大白菜中應用，在甘藍中報道較少，這與根腫病抗性基因多存在于蕪菁和大白菜中有關。本試驗利用SCAR 標記（OA）與SSR 標記（B0902）對表現免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘藍類蔬菜材料進行分子標記輔助選擇，結果表明4 份材料含有基因，8 份材料含有CRb基因，其中Cr5、綠抗9 號、青蓮甘藍、S296 含有基因和CRb基因2 個抗性位點，可將這4 份材料直接應用到甘藍抗根腫病育種中，而Cr5、綠抗9 號、青蓮甘藍是雄性不育材料，需要利用專用恢復系進行育性恢復，然后再應用到抗病育種中（Li et al.，2021）。