兒童結腸息肉中NLRP3、miR-22-3p表達及對疾病進展的影響*

郭小剛， 羅培燕， 彭 雷

(重慶市黔江中心醫院 普外科， 重慶 409000)

兒童結腸息肉臨床常表現為間歇性無痛性鮮血樣便，疾病原因是結腸黏膜表面隆起并向腸內突起[1-2]。研究顯示結腸息肉的進展與結腸癌的發生發展有關，息肉病變類型中腺瘤性息肉更易發生癌變[3]。因此，探尋結腸息肉疾病進展中相關生物標志物以監測癌變發生風險，對于阻斷和預防結腸癌發生有重要臨床價值。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是體內固有免疫的組分，在炎癥反應中有重要作用[4]。李瀟等[5]研究顯示，NLRP3在潰瘍型結腸炎患者結腸組織中高表達。微小RNA-22-3p(microRNA-22-3p，miR-22-3p)與結直腸癌細胞增殖、遷移等密切相關[6]。應用生物信息學軟件預測發現，NLRP3與miR-22-3p間存在靶向調控作用[7]，但二者在兒童結腸息肉中的作用仍缺乏研究。因此，本研究旨在探究NLRP3及miR-22-3p在結腸息肉疾病進展中的表達分析兒童結腸息肉疾病進展中的影響因素，為監測結腸息肉疾病進展提供可靠的臨床生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1對象 選取2019年11月—2021年5月住院治療的98例結腸息肉患兒，3～12歲，其中幼年性息肉52例、腺瘤性息肉46例，另選取相對應患兒正常結腸組織作為對照，收集整理98例患兒性別、年齡、息肉部位、息肉數目、黏膜狀態及息肉直徑等臨床資料。納入標準：(1)結腸息肉經內鏡及病理檢查確診；(2)組織標本完整、且臨床資料齊全；(3)入組前未進行過術前治療，研究經醫院臨床研究倫理委員會批準，患兒或家屬均自愿參加。排除標準：(1)有先天性腸管畸形或家族性息肉病者；(2)哭鬧嚴重、不能配合完成實驗者；(3)有腸道惡性腫瘤或其他部位惡性腫瘤者；(4)有肝腎功能不全者。

1.1.2主要試劑與儀器 免疫組化試劑盒(貨號XY--0022)購自上海信裕生物科技有限公司，NLRP3抗體(貨號FNab10120)購自武漢菲恩生物科技有限公司，miRNA提取試劑盒(貨號AM1556)購自美國Life公司，miRNA反轉錄試劑盒(貨號D1802)購自海基生物科技有限公司，SYBR Green RT-PCR Master Mix(貨號HY-K0521)購自美國MedChemExpress公司，光學顯微鏡(型號CX23)購自日本OLYMPUS公司，qRT-PCR儀(型號CFX96)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1樣品采集及保存 采集結腸息肉患兒術中正常結腸組織以及息肉組織、腺瘤性息肉組織，液氮保存待測。

1.2.2miR-22-3p表達水平檢測 按照試劑盒操作說明提取組織總RNA并合成cDNA，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-22-3p相對表達量，引物序列見表1。反應總體積為20 μL：cDNA模板(50 mg/L)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR Green RT-PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 8.0 μL，重復3次。以U6為內參，采用2-ΔΔCT法(CT代表循環閾值)計算目的基因miR-22-3p的相對表達量。根據98例結腸息肉患兒miR-22-3p相對表達量中位值(0.48)，將其分為miR-22-3p高表達49例、miR-22-3p低表達49例。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primers of qRT-PCR

1.2.3NLRP3蛋白水平測定 對各組織標本進行處理(采用40 g/L多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、連續切片)后，按試劑盒操作說明進行免疫組化染色(PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照)，之后每張切片隨機選5個視野(10×40倍)觀察，并計數200個細胞，由3名人員獨立采用半定量法評判。首先按照陽性細胞所占百分比計分，陽性細胞比例1/3以下計1分、1/3～2/3計2分、2/3以上計3分；然后按染色強度計分，棕褐色計3分、棕黃色計2分、淺黃色計1分、無著色計0分；兩次評分乘積為最終得分，≤2分為陰性表達、>2分為陽性表達。根據98例結腸息肉患兒NLRP3蛋白表達情況，將其分為NLRP3陰性表達38例、NLRP3陽性表達60例。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 NLRP3陽性表達和miR-22-3p相對表達量

與正常結腸組織比較，幼年性息肉組織、腺瘤性息肉組織中NLRP3陽性表達率逐漸升高，miR-22-3p相對表達量逐漸降低，各組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 NLRP3陽性表達和miR-22-3p相對表達量Tab.2 Comparison of NLRP3 positive expression and relative expression of miR-22-3p

注： A為正常結腸組織，B為幼年性息肉組織，C為腺瘤性息肉組織。圖1 各組組織中的NLRP3蛋白陽性表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.1 Positive expression of NLRP3 protein in the tissues of each group(immunohistochemical method,×400)

2.2 不同臨床病理特征結腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達

不同性別、年齡、息肉部位、黏膜狀態患兒結腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；腺瘤性息肉、息肉多發、息肉直徑≥2.5 cm的結腸息肉患兒中NLRP3陽性表達、miR-22-3p低表達的比例逐漸升高(P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床病理特征結腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達[n(%)]Tab.3 Expression of NLRP3 and miR-22-3p in CP with different clinicopathological features[n(%)]

2.3 兒童結腸息肉發展為腺瘤性的單因素和多因素分析

以兒童結腸息肉是否發展為腺瘤性作為因變量，以性別、年齡、息肉部位、息肉數目、黏膜狀態、息肉直徑、NLRP3、miR-22-3p為自變量進行單因素Logistic回歸分析，再以單因素分析中有統計學意義的息肉數目、息肉直徑、NLRP3、miR-22-3p為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，NLRP3是影響結腸息肉發展為腺瘤性的獨立危險因素(P<0.05)，miR-22-3p是影響結腸息肉發展為腺瘤性的保護因素(P<0.05)。見表4、表5。

表4 兒童結腸息肉發展為腺瘤性的單因素分析Tab.4 Univariate analysis of adenomatous CP in children

表5 兒童結腸息肉發展為腺瘤性的多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of adenomatous CP in children

3 討論

結腸息肉是兒童腸道常見病，主要由黏膜過度生長所致，其發展過程中極易惡變[8]。結腸息肉發病機制目前尚不清楚，可能與環境、遺傳、基因異常表達等因素有關[9-10]。結腸息肉早期時息肉直徑較小，臨床癥狀缺乏特異性，極易被忽視，使得部分患者就診時已發展為腺瘤，或已出現癌變[11-12]。因此，尋找與結腸息肉發展過程相關的生物標志物，已成為目前的研究熱點。研究表明，結腸黏膜長期的炎性刺激是結腸息肉公認的病因之一[13]。NLRP蛋白家族作為炎性小體的關鍵組成部分，其在纖維化、腫瘤及炎癥等發生發展中有重要作用[14-15]。NLRP3受高血糖、游離脂肪酸、低密度脂蛋白等多種激活因素刺激和調節，其激活后可誘導多種炎性因子的成熟及分泌，引發組織損傷及炎癥級聯反應[16]。miR-22-3p是哺乳動物中常見的miRNA之一，廣泛表達于各類細胞和組織中，可通過與靶基因3′非編碼區特異結合，導致靶基因沉默、抑制蛋白質表達等，進而在疾病的發生發展中發揮重要作用[17-18]。Wang等[19]研究結果顯示，miR-22-3p通過靶向NLRP3抑制尿酸單鈉誘導的痛風性炎癥。Hu等[20]研究中miR-22-3p通過靶向NLRP3對視網膜色素上皮炎性損傷發揮保護作用。而本研究結果同樣顯示結腸息肉組織中NLRP3與miR-22-3p存在負相關，與既往研究文獻以及生物信息學軟件預測結果一致。此外，本研究結果中NLRP3及miR-22-3p在結腸息肉組織中分別表達上調和下調，腺瘤性息肉、息肉多發、息肉直徑≥2.5 cm的結腸息肉患兒中NLRP3陽性表達、miR-22-3p低表達的比例較高，且二者均是結腸息肉疾病進展的影響因素。王洪等[21]研究結果表明，NLRP3的異常表達將引發免疫紊亂，刺激炎性因子的釋放，減弱腸道免疫應答，引發炎癥性腸病。結合NLRP3與miR-22-3p間的調控關系結果及既往文獻中NLRP3在兒童炎癥性腸病免疫機制中的作用，推測兒童正常結腸組織在炎癥等作用下出現結腸息肉，miR-22-3p在病理作用下表達水平降低，miR-22-3p負調控NLRP3使其蛋白表達升高，NLRP3作為免疫應答的重要組成部分，其異常高表達會進一步引發免疫紊亂，造成腸道微生態菌群發生改變，誘導多種炎性因子的成熟和分泌，引發炎癥級聯反應，使腸道免疫應答減弱，而結腸粘膜在炎癥的反復刺激下發生腺瘤性病變。

綜上所述，正常結腸組織、幼年性息肉組織、腺瘤性息肉組織中NLRP3陽性表達率逐漸升高、miR-22-3p相對表達量逐漸下調，且二者均是結腸息肉疾病進展的影響因素。NLRP3及miR-22-3p有望成為監測結腸息肉癌變的重要生物學指標，同時本研究為進一步探索新的治療靶標提供依據。然而NLRP3及miR-22-3p參與結腸息肉疾病進展的機制有待進一步探究，樣本量需進一步擴大。