股骨頭壞死愈膠囊對酒精干預大鼠成骨細胞堿性磷酸酶表達的影響*

孫 楠,陳曉波,李 納,丁 強,孫永強

(河南省洛陽正骨醫院，河南 鄭州 450016)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是臨床常見的難治性疾病之一，一般分為創傷性和非創傷性兩種。非創傷性ONFH多見于中青年，致病因素多達40余種，其中大量酗酒是其主要原因之一。研究[1]顯示，20%～45%的ONFH與飲酒有關。過度飲酒可影響局代謝正常進行，同時可導致脂代謝異常、骨髓間充質干細胞異常分化。若ONFH未經有效治療，則股骨頭塌陷使關節功能損毀，嚴重影響患者的生活質量，因此如何預防和治療ONFH成為骨科領域的一項世界性難題。非創傷性ONFH的病因最常見為激素和酒精。二十世紀七十年代報道的非創傷性ONFH病例中，酒精性占39%～74%[2]；而激素性ONFH，1960 年以前僅見20余例，1964-1977年間增至450例[3]。在2000年的報道中，酒精性ONFH占46%,激素性ONFH占34%[4]，酒精因素所占的比例高于激素。伴隨醫學的發展、激素的廣泛使用，激素性ONFH日漸增多。2003年，激素性ONFH占50%，酒精性ONFH占27%[5]；2006年，激素性ONFH占49.7%，酒精性ONFH占33.6%[6]。目前，雖然酒精在ONFH致病因素中所占比例已被激素超過，但仍是主要的致病因素。酒精性ONFH的病因病機尚不明確，故其治療效果欠佳。股骨頭壞死愈膠囊是河南省洛陽正骨醫院治療股骨頭壞死的經驗方，由鹿茸、杜仲、續斷、黃芪、雞血藤、連翹、乳香(制)、沒藥(制)組成，由河南省洛正制藥廠生產，具有一定的臨床療效[7-10]。本實驗采用酶消化法分離SD鼠新生24 h內乳鼠股骨中成骨細胞，原代培養，取P3代細胞消化制成單細胞懸液。通過觀察股骨頭壞死愈膠囊對體外培養的大鼠成骨細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表達的影響來進一步探索股骨頭壞死愈膠囊對骨代謝的作用，以期為揭示其治療ONFH的作用機制提供細胞層面的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(specific pathogen free, SPF) 級SD大鼠新生24 h內乳鼠6只，不計體質量、不分雌雄，由河南省動物實驗中心提供，動物生產許可證號為SCXK(豫)2019-0002，動物使用許可證號為SYXK(豫)2020-0008。

1.2 藥品、試劑與儀器

股骨頭壞死愈膠囊，河南省洛陽正骨醫院產品，批號20200507，0.35 g×60粒；胎牛血清(FBS)，以色列BI公司產品，批號04-001-1A；L-DMEM培養基(批號31600)、青鏈霉素混合液(100×，細胞培養專用，批號P1400)、核糖核酸酶A(RNase A，批號R8020)、碘化丙啶(PI,批號C0080)、高效RIPA裂解液(批號R0010)，均為北京索萊寶科技有限公司產品；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，批號PWL050)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號MB9898)、細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK8，批號MA0218)，均為大連美侖生物技術有限公司產品；無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司產品，批號64-17-5；Rat BALP ELISA KIT，上海凡科維生物技術有限公司產品，批號F40061-A；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京全式金生物技術有限公司，批號DQ111-01。CHW-160L型CO2培養箱，常州金壇良友儀器有限公司產品； Tecan Spark酶標儀，帝肯(上海)貿易有限公司產品；RJ-TGL-1850R型醫用離心機，瑞江市分析儀器有限公司產品；NovoCyte流式細胞儀，美國安捷倫科技(中國)有限公司產品；EZ4型普通顯微鏡，德國徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司產品；TE2000-E型尼康倒置顯微鏡，日本尼康株式會社產品；JY600C型電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司產品。

1.3 成骨細胞的分離培養

將乳鼠頸椎脫臼處死，置體積分數750 mL/L乙醇溶液內浸泡10 min；取出后放入培養皿，取雙側股骨，剔除肌肉組織，放入PBS緩沖液浸泡；剪下股骨頭，用眼科手術剪剪碎；PBS沖洗3次，沖洗干凈；加質量分數2.5 g/L胰蛋白酶4 mL消化30 min，自然沉淀后去上清；組織塊加質量分數1.5 g/LⅡ型膠原酶5 mL，于37 ℃消化3 h；加4 mL含體積分數100 mL/L FBS的L-DMEM培養基終止消化收集細胞，以10 cm的離心半徑、1 000 r/min的轉速離心5 min；棄上清，調整細胞密度，轉移入25 cm2培養瓶中，使用100 mL/L FBS-L-DMEM培養基進行貼壁培養，置于37 ℃、含體積分數50 ml/L的CO2培養箱中培養；每3天更換1次培養液；待生長細胞鋪滿平皿80%后，進行傳代、凍存及各階段實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 成骨細胞形態學觀察

取P0、P1和P2代細胞，以質量分數2.5 g/L胰蛋白酶消化；制成細胞懸液，調整細胞密度；將蓋玻片置于培養皿中，接種細胞，置入體積分數50 mL/L的CO2培養箱中；待細胞長成單層，取出蓋玻片，PBS沖洗3次；體積分數950 ml/L乙醇溶液浸泡15 min；PBS沖洗2次，每次沖洗1 min； HE染色；中性樹膠封片；普通顯微鏡觀察。

1.4.2 成骨細胞CCK8法繪制細胞生長曲線

取P2代成骨細胞，按1×104個細胞/孔接種于10個96孔板，每組設置4個重復，常規培養24，48，72，96，120，144，168，192，216，240 h。于上述10個時間點，各取一板，向每孔加入10 μL CCK8溶液的培基(CCK8溶液與培養基按照1∶9的比例混勻)，37 ℃下培養2 h，測量450 nm處 OD值，繪制生長曲線，以了解成骨細胞生長周期從而確定藥物干預時間、測定時間點。

1.4.3 成骨細胞ALP表達

取P3代細胞消化制成單細胞懸液。設股骨頭壞死愈膠囊組、酒精組和空白對照組(培養基組)。股骨頭壞死愈膠囊組設140，210，280，336，420，560，672，750，840 mg/L 9個藥物梯度。酒精組給以酒精濃度為0.09 mol/L的培養基，股骨頭壞死愈膠囊組給以0.09 mol/L酒精及相應濃度的股骨頭壞死愈膠囊溶液的培養基，在同等條件下培養；于培養第7天和第14天收集上清液，檢測ALP含量；收集對應的細胞提取蛋白，求取單位蛋白含量下對應的ALP含量。根據ALP含量選取關鍵藥物濃度值，分別測定關鍵藥物濃度值組、空白對照組，酒精組培養第7天和第14天的ALP蛋白含量，并進行組間比較。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 成骨細胞形態學觀察

普通顯微鏡觀察分離純化的P0、P1和P2代成骨細胞，可見：各代細胞均呈現單層分布，呈單核梭形細胞、單核三角形細胞及單核多邊形細胞，活躍的成骨細胞為梭形、錐形，胞漿嗜堿性。細胞核位于細胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細胞連接，細胞緊密排列。鏡下觀符合成骨細胞的特點。見圖1。

2.2 成骨細胞生長曲線

P2代成骨細胞生長曲線較為典型。根據生長曲線可知：24～72 h，細胞生長較為緩慢，故可將此期視為潛伏期；96～192 h，細胞呈現出較大斜率的指數生長期；216 h附近時，細胞生長到達平頂期；240 h時，細胞出現退化、衰亡。見圖2。

2.3 各組成骨細胞ALP水平對比

空白對照組、酒精組和股骨頭壞死愈膠囊不同藥物濃度對ALP含量的影響，見表1。由表1可知，培養第14天，股骨頭壞死愈膠囊藥液濃度為750 mg/L時，ALP含量最高。在培養的第7天和第14天，股骨頭壞死愈膠囊藥液濃度在140～750 mg/L區間時，ALP含量隨著藥物濃度的增加而增加；當750 mg/L濃度時，ALP含量達到高峰；藥物濃度840 mg/L時，ALP含量出現下降。因此，選定股骨頭壞死愈膠囊藥液濃度為750 mg/L作為觀察濃度。見圖3和圖4。750 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組、空白對照組、酒精組在培養第7天和第14天時的ALP含量對比，750 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組ALP含量高于酒精組和空白對照組，差異具有統計學意義，見表2。

表1 各組培養第7天、第14天成骨細胞ALP含量對比

分組第14天OD值蛋白含量/(g·L-1)ALP含量/(μg·L-1)ALP/蛋白/(μg·g-1)空白對照組0.302.395.852.45酒精組0.302.795.261.89140 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.302.405.102.12210 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.272.024.482.22280 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.271.944.282.20336 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.271.955.112.62420 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.261.814.082.25560 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.200.945.575.95672 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.180.655.077.78750 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.170.606.4610.87840 mg/L股骨頭壞死愈膠囊組0.170.574.207.43

表2 3組第7，14天ALP/蛋白含量對比

3 討 論

目前股骨頭壞死的發病原因尚不明確。研究[11-12]發現：規律飲酒患者ONFH發病危險性高，而且具有明顯量效關系。每周酒精攝入量<400 mL、400～1 000 mL和≥1000 mL的患者，其相對危險度分別為3.3，9.8，17.9。酒精性股骨頭壞死因其致殘性高越來越受到學者及臨床醫生的重視，治療時主要根據其疾病分期、分型采用保守治療、髓芯減壓、骨(血管化/非血管化)移植、髖關節置換等方法[13-14]，效果參差不齊。

在股骨頭壞死的病理過程中，骨的壞死和修復同時存在。成骨細胞在骨代謝的整個過程有重要作用，是參與骨形成的重要功能性細胞，對骨發育和新生骨內環境穩定具有重要意義，同時參與成骨過程及破骨細胞骨吸收功能的調節[15-18]。成骨細胞有細胞生長周期。本實驗通過觀察成骨細胞體外生長曲線了解成骨細胞在體外的生長規律，并依此確定藥物干預的觀察時間窗。本實驗結果顯示：體外培養24～72 h成骨細胞生長較為緩慢，可視為潛伏期；96～192 h呈現出較大斜率的指數生長期；216 h附近到達平頂期；240 h出現退化衰亡。依此選定成骨細胞生長第7天(最為活躍時間)和第14天(進入退化衰亡期)作為實驗關鍵時間點。

ALP是一種普遍存在的膜結合糖蛋白，在堿性pH值下催化磷酸單酯的水解。ALP根據組織表達部位分為4種同工酶，即腸ALP、胎盤ALP、生殖細胞ALP和組織非特異性ALP或肝/骨/腎ALP[19-22]。骨同功酶可能參與哺乳動物的骨鈣化[23]。本研究將P3代成骨細胞分為股骨頭壞死愈膠囊組、酒精組和空白對照組，觀察不同藥物梯度對ALP表達的影響,觀察時間點為培養第7天和第14天。結果表明：培養第7天酒精組ALP的表達量較空白對照組ALP的表達量低，說明酒精抑制了成骨細胞ALP的表達，從而抑制骨形成。在培養第14天時,酒精組與空白對照組的ALP表達沒有差異，可能是細胞生存活性整體下降所致。藥物濃度與ALP具有相關性，藥物濃度在140～750 mg/L區間內，ALP表達量隨著藥物濃度的升高而逐漸提高，但濃度在840 mg/L時 ALP表達量出現下降，說明在140～750 mg/L區間內加大藥物濃度可使骨代謝更加活躍，藥物濃度在750 mg/L時ALP的表達達到峰值。第7天ALP表達量高于第14天的表達量，但是兩者趨勢相同，說明第14天因成骨細胞進入退化衰亡導致成骨減慢。

綜上所述，中藥股骨頭壞死愈膠囊可促進體外骨細胞ALP的表達，此可能是股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死的機制，即股骨頭壞死愈膠囊促進成骨細胞ALP的表達，促進骨的生發，從而促進新骨的形成而達到治療股骨壞死的臨床效果。