基于網絡藥理學探討補陽還五湯治療冠心病的作用機制*

張劍劍，閆奎坡，馮 娟，郭雨晴，孫彥琴 ，劉 剛

(1河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2河南中醫藥大學第一附屬醫院心臟中心，河南 鄭州 450000)

冠心病(coronary heart disease,CHD)是指由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導致心肌缺血、缺氧或壞死而引發的心臟病。隨著老齡化進程的加劇, 我國冠心病的發病和病死人數將持續增加[1]。冠心病屬中醫學“胸痹”“心痛”“真心痛”范疇，多與瘀血、痰飲、寒邪、體虛、勞累、情志等致病因素有關。補陽還五湯是出自清代醫家王清任所著《醫林改錯》的經典名方，具有補氣活血通脈的功效，治療冠心病的療效已得到臨床的認可[2-4]。現代藥理學研究證明，補陽還五湯可調節斑塊內細胞自噬水平，減少炎癥因子的釋放，降低動脈硬化斑塊面積，降低血脂水平，從而達到抗動脈粥樣硬化的作用[5]；可促進新生血管的生成,改善血流供應,抑制細胞凋亡,保護受損心肌[6]。隨著科技的發展，針對中醫藥的現代化研究不斷出現，本研究嘗試利用中藥系統藥理學分析平臺，通過網絡藥理學構建多靶點蛋白與基因的互作關系，探討補陽還五湯治療冠心病的作用機制，探索補陽還五湯的現代科學內涵，以期為該方在臨床的合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 補陽還五湯藥物活性成分及靶點的獲取與收集

利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)對補陽還五湯中的7味中藥的活性成分、靶點分別進行檢索。檢索關鍵詞分別是 “黃芪”“當歸尾”“赤芍”“地龍(去土)”“川芎”“紅花”“桃仁”標準中文名稱或拉丁文名稱，設定口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，收集符合條件的中藥活性成分。收集到主要活性成分的作用靶點后，利用Uniprot 數據庫(https://uniprot.org/)得到對應靶點的基因號及標準化名稱。

1.2 冠心病疾病靶點的獲取

設定關鍵詞為“coronary heart disease”，使用GeneCards(https://www.genecards.org/ )和OMIM(https://www.omim.org/)數據庫及文獻查閱，對冠心病的相關疾病靶點進行檢索，收集并整合數據。

1.3 篩選藥物與疾病共同靶點并構建互作網絡

使用R語言軟件獲得藥物與冠心病疾病的共同靶點，繪制出維恩圖(Venn圖)。將得到的共有靶點信息輸入String平臺(https:// string-db.org/)，將物種定義為“homo sapiens”， 選擇置信度>0.90，隱藏離散節點，構建富集分析與蛋白質互作用網絡(PPI)網絡圖，分別保存PNG、TSV格式。利用R軟件對靶點的節點進行統計分析并呈現可視化。

1.4 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖構建

使用 Cytoscape 3.8.0 軟件(http://www.cytoscape.org/)構建藥物、活性成分、靶點、疾病互作網絡圖，網絡圖中的節點(node)分別代表活性成分、藥物、疾病、靶點，邊(edge)代表不同節點之間的相互聯系。

1.5 GO分析和 KEGG 通路富集分析

應用R軟件對在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)在線數據庫得到的藥物與疾病共同靶標基因進行GO分析和KEGG通路富集分析。以P<0.05、q<0.05作為條件進行過濾，將前20條基因生物過程和信號通路通過高級氣泡圖和通路圖進行可視化分析。

2 結 果

2.1 補陽還五湯的主要活性成分及作用靶點

使用 TCMSP 數據庫分別檢索黃芪、當歸尾、赤芍、地龍(去土)、川芎、紅花、桃仁的活性成分，以藥動學參數OB≥30%和 DL≥0.18為篩選條件，用當歸尾代替當歸，去除地龍，篩選后初步得到活性成分結果為黃芪20個，赤芍29個，川芎7個，當歸2個，紅花22個，桃仁23個。由于篩選條件的限制，許多含有廣泛藥理學作用的成分未被選中，比如阿魏酸、芍藥苷、黃芪甲苷、紅花黃色素等。為了提高預測的全面性、可靠性，根據文獻查詢的方式增加相關活性成分黃芪12個、赤芍4個、川芎1個、當歸1個、紅花2個，剔除重復后共得到111個活性成分。通過TCMSP數據平臺檢索到各藥物的作用靶點共1 489個。對主要活性成分對應的作用靶點進行整理，并通過 UniProt數據庫將其基因名稱統一轉換為標準化基因名稱，共獲得藥物作用靶點基因980個，刪除重復，共獲得231個藥物作用靶點基因。補陽還五湯主要活性成分及作用靶點基本信息見表1。

表1 補陽還五湯主要活性成分及作用靶點基本信息

續表1 補陽還五湯主要活性成分及作用靶點基本信息

續表1 補陽還五湯主要活性成分及作用靶點基本信息

2.2 疾病靶點的篩選

通過GeneCards、OMIM數據庫獲得冠心病潛在疾病作用靶點共7 557個，將得到的靶蛋白信息通過 UniProt數據庫統一轉換為人源(homo sapiens)的標準化基因名。

2.3 藥物與疾病共同靶基因及PPI網絡構建

將篩選得到的231個藥物靶基因、7 557個疾病靶基因，應用聯川生物平臺Bio-Venn(http://www.biovenn.nl/index.php)繪制Venn圖(見圖1)，獲得共同作用靶基因192個(見表2)。將192個共同靶基因在 STRING 平臺進行 PPI 網絡分析，去除游離節點，并進行可視化處理(見圖2)。使用R軟件對出現頻次較高的前20個節點進行統計并繪制柱狀圖(見圖3)。可以看到AKT1、JUN、MAP激酶(MAPK1、MAPK8、MAPK14)、RELA、APP、白細胞介素(IL-6、CXCL8)、FOS、CTNNB1、ESR1、表皮生長因子受體(EGFR)、PRKCA、血管內皮生長因子A(VEGFA)等關聯程度較高，是整個網絡中最重要的基因蛋白。

表2 藥物與疾病共同作用靶基因

續表2 藥物與疾病共同作用靶基因

2.4 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖

使用cytoscape3.8.0 構建藥物-活性成分-靶點-疾病互作網絡圖(見圖4)。共有303個節點(疾病1 個，藥物 6個，有效活性成分65個，基因靶點231個)和 1 105條連線。結果顯示，HH16 quercetin(槲皮素)、HH14 Luteolin(木犀草素)、HQ5 isorhamnetin(異鼠李素)、CS5、DG1、HH11和TR16 中均含有的β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川芎嗪 (CX5 tetramethylpyrazine)、芍藥苷(CS3 paeoniflorin)等化合物連線較為密集，可能是補陽還五湯治療冠心病發揮療效的核心活性成分。

2.5 GO基因生物過程和KEGG信號通路富集分析

應用R軟件進行GO富集分析，共得到172條生物過程，將P值最小的前20條生物過程繪制成柱狀圖、氣泡圖(見圖5、圖6)。從圖中可以看出，其中核激素受體結合(nuclear hormone receptor binding)、配體激活轉錄因子活性 (ligand-activated transcription factor activity)、DNA結合轉錄激活物活性(DNA-binding transcription activator activity)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、血紅素結合(heme binding)、四吡咯結合(tetrapyrrole binding)、細胞因子受體結合(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen、cytokine receptor binding)、肽結合(peptide binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、protein heterodimerization activity等生物過程中靶基因較為集中。

通過R軟件進行KEGG分析，設置P<0.05、q<0.05進行篩選，共得到33條信號通路，排除廣泛通路，選擇P值最小的前20 條信號通路展示信息，同時繪制高清柱狀圖(見圖7)、氣泡圖(見圖8)。從圖中可以看出，靶基因主要分布在Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、TNF signaling pathway、Hepatocellular carcinoma等信號通路上。

3 討 論

補陽還五湯由黃芪、赤芍、川芎、當歸尾、紅花、桃仁、地龍7味中藥組成。方中黃芪味甘性溫，大補元氣，取其氣旺行血祛瘀之意，為君藥；當歸尾味甘、辛，性溫，活血祛瘀又不傷血，為臣藥；川芎、赤芍、桃仁、紅花助歸尾活血祛瘀血之效，為佐藥；地龍味咸性寒，通經活絡，為使藥。諸藥合用，合奏補氣活血通脈之效，適用于氣虛、血瘀所致胸痹 。

本研究基于網絡藥理學，并通過整合生物信息學方法，對補陽還五湯治療冠心病的作用機制進行了初步探析。結果發現，共收集藥物活性成分111個，藥物作用靶點231個，與冠心病共同靶基因192個，其中核心蛋白有AKT1、JUN、MAP激酶(MAPK1、MAPK8、MAPK14)、RELA、APP、白細胞介素(IL-6、CXCL8)、FOS、CTNNB1、ESR1、EGFR、PRKCA、VEGFA。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 是PI3K/AKT信號通路上的重要因子，可調節細胞的增殖、凋亡、分化，以及遷移等，參與的PI3K/AKT信號通路是腫瘤、冠心病、代謝紊亂等多種疾病的病理形成過程[7]。JUN屬于核轉錄激活因子(AP-1)，廣泛參與細胞增殖、凋亡、存活等[8]， AP-1通過調節細胞內信號通路可對動脈粥樣硬化的形成及進展過程進行調控,也能在維持動脈粥樣硬化斑塊穩定性方面發揮作用[9]。MAPK1因遺傳多態性可能影響冠心病的血脂代謝和凝血功能,還可能參與冠心病的炎性反應[10]。MAPK信號通路參與炎癥反應，促進了動脈粥樣硬化的發生和發展[11]。IL-6作為多功能的炎癥細胞因子，在心肌缺血再灌注損傷發生發展過程中具有雙重作用, 既能損傷心肌又能限制缺血面積擴大[12]。EGFR是一種受體型蛋白酪氨酸激酶,廣泛表達于包括心臟和血管的正常組織,是調控許多基本的細胞生物過程如分化、增殖、遷移等的重要因子，過表達或過度刺激可以導致細胞生長紊亂和組織重構[13]。VEGF可促進血管生成,在動物的動脈損傷模型及冠狀動脈結扎模型中, 應用VEGF基因轉導可觀察到VEGF成功表達, 并可促進血管形成, 增加側支循環, 有效抑制損傷血管的再狹窄[14]。

由“藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖”可見，補陽還五湯治療冠心病涉及的關鍵有效成分有槲皮素、木犀草素、異鼠李素、β-谷甾醇、川芎嗪、芍藥苷等化合物。槲皮素可能通過調節介導的氧化應激、抑制清道夫受體表達，減少氧化低密度脂蛋白吸收、影響自噬相關蛋白的表達來發揮保護高脂膳食誘導ApoE KO小鼠動脈粥樣硬化的作用；槲皮素可能通過上調PI3K/AKT/mTOR通路降低膿毒癥小鼠心肌組織炎癥和氧化應激反應,從而減輕心肌損傷[15-16]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥、抑制氧化應激發揮抗動脈粥樣硬化作用，通過激活PI3K/Akt信號通路、抑制TLR-4/NF-κB信號通路發揮心肌缺血再灌注損傷保護作用[17]。異鼠李素通過調控H9c2心肌細胞自噬及凋亡通路蛋白表達，提高細胞存活率，減輕心肌損傷[18]；異鼠李素能抗動脈粥樣硬化、抗血栓、抗高血壓、降血脂、抑制心肌肥大等，在心血管系統方面具有重要作用[19]。β-谷甾醇具有降低膽固醇、甘油三酯及脂肪酸的作用[20]，并且具有心血管保護作用[21]，動物實驗證實其可能參與氧化應激、炎癥反應和凋亡途徑抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷[22]。川芎嗪是從中藥川芎提取的主要單體成分之一，具有改善心肌缺氧狀況、保護心肌細胞及心肌缺血再灌注損傷等作用[23]。芍藥苷對垂體后葉素致大鼠實驗性心肌缺血有顯著的預防性保護作用,對結扎犬冠狀動脈缺血模型有明顯的抗心肌缺血作用[24]。

GO基因生物過程顯示,補陽還五湯治療冠心病與其靶基因參與的nuclear hormone receptor binding、ligand-activated transcription factor activity、DNA-binding transcription activator activity、RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding、heme binding、tetrapyrrole binding、oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen、cytokine receptor binding、peptide binding、cytokine activity、protein heterodimerization activity關系密切。KEGG通路富集分析結果顯示，補陽還五湯治療冠心病主要涉及Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、TNF signaling pathway、Hepatocellular carcinoma等信號通路。有研究表明，在生理狀態下，剪切力可通過維持內皮細胞穩態發揮抗動脈粥樣硬化作用，病理剪切力則會導致內皮功能障礙，促進動脈粥樣硬化進展[25]。心肌細胞Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白的下調，Bax和Caspase-3蛋白的上調，可以激活PI3K/Akt通路，促進細胞凋亡，此過程可能是冠心病痰瘀互結證的發病機制之一[26]。也有大量研究證實，PI3K/Akt是細胞內非常重要的信號轉導途徑，在細胞的生長、增殖、凋亡、血管生成、自噬等方面起著重要作用[27-29]。以上均說明補陽還五湯可能通過干預細胞凋亡、脂代謝、炎癥反應、免疫調節等發揮治療冠心病的作用。

本研究基于網絡藥理學，初步探討了補陽還五湯治療冠心病的作用機制，結果涉及眾多成分、靶點，參與多條生物進程及信號通路。本次研究基本與以往研究相符合，基于計算機數據庫得出的結論，需要更多動物實驗進行佐證，希望能夠為今后的進一步相關研究提供依據和思路。