基于原生質體的谷子CRISPR/Cas9 基因編輯系統優化

劉光宇，徐曉靜，夏科科，孫海汐，陶月如，崔 震，顧 穎

（深圳華大生命科學研究院，廣東 深圳 518083）

谷子（Setaria italica）作為1 年生的二倍體禾本科植物，主要在亞洲、非洲北部、南美洲和北美洲的干旱和半干旱地區種植，是優質的糧飼兼用作物[1-2]。由于谷子基因組較小、生育期短、自花授粉、種質資源豐富、與其他主糧作物和生物質能源草本植物關系密切，有巨大的潛力成為模式作物以更好地了解C4 植物的光合作用[3-4]。雖然在過去的20 a谷子的遺傳轉化效率較低（5.5%～9.0%），但最近高效的谷子遺傳轉化方法已經被報道，轉化效率高達19.2%，這使得利用基因編輯工具進行谷子功能基因研究和遺傳改良成為可能[5-8]。

CRISPR/Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統是進行基因編輯的重要工具之一。該系統由gRNA（Guide RNA）引導Cas9 在靶位點通過識別前間隔序列鄰近基序（PAM）產生雙鏈DNA 斷裂，隨后通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）機制引入基因突變[9]。NHEJ 主要通過產生短小的核苷酸插入或缺失造成基因突變，而HDR介導的基因組編輯可在目標DNA 序列中精確引入所需的基因片段[10]。

CRISPR/Cas9 系統已被廣泛有效地應用于包括植物在內的多種生物的靶向基因突變。將CRISPR/Cas9 系統應用于一個新的植物物種時，首先需要針對系統中的表達元件，如啟動子、Cas9和gRNA 等進行優化。內源性的組成型啟動子和密碼子優化可以提高Cas9 在宿主內的表達水平[11-16]。gRNA 表達元件呈現多元化，比如單一gRNA、雙gRNA 串聯和基于tRNA 的工具包等。增加gRNA 數量可以使gRNA表達元件釋放更多成熟的gRNA，增加Cas9的靶位點，進而提高基因編輯效率或進行多位點的同時編輯[17-20]?！?br>