絞股藍皂苷A調控lncRNA TTTY15/miR-335-5p通路對骨關節炎軟骨細胞損傷的影響及機制

牛帥帥 孫卓偉 王承群

骨關節炎是臨床常見的一種慢性退行性關節疾病，主要特征為關節軟骨退化、滑膜炎癥及骨贅形成，目前骨關節炎藥物治療方案較少，同時非藥物治療的方案治療效果不佳[1]。近年來，中草藥在骨關節炎的治療中發揮重要作用，并可減輕骨關節炎軟骨細胞損傷[2,3]。絞股藍皂苷是葫蘆科植物絞股藍的活性成分，具有抗氧化、保護神經功能等作用，絞股藍皂苷可促進成骨細胞增殖分化，而抑制細胞氧化應激[4]。絞股藍皂苷A是皂苷的主要有效成分，但絞股藍皂苷A與骨關節炎軟骨細胞損傷相關研究筆者所見相對較少。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA中常見類型，其在機體中廣泛存在，其表達異常可通過競爭性結合miRNA而參與多種疾病發生及發展，研究表明lncRNA TTTY15在過氧化氫誘導的心肌細胞中表達水平升高，敲低其表達可通過調節miR-98-5p/CRP軸而減輕過氧化氫誘導的心肌細胞損傷[5]。生物信息學預測顯示TTTY15與miR-335-5p存在結合位點，研究表明miR-335-5p在骨關節炎軟骨細胞中表達水平降低，上調其表達可抑制軟骨細胞炎性反應[6]。但絞股藍皂苷A是否可通過調控TTTY15/miR-335-5p通路而影響骨關節炎軟骨細胞損傷尚未可知。因此，本研究采用IL-1β誘導軟骨細胞建立骨關節炎軟骨細胞損傷模型，探討絞股藍皂苷A對骨關節炎軟骨細胞炎癥、氧化應激、增殖及凋亡的影響及其對TTTY15/miR-335-5p通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 絞股藍皂苷A購自西安天豐生物；IL-1β購自南京金斯瑞生物；SYBR Green PCR試劑購自德國Qiagen；Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自北京天根生化；TNF-α、IL-6、SOD、MDA檢測試劑盒購自南京建成生物；miR-NC、miR-335-5p mimics、si-NC、si-TTTY15購自上海吉瑪；pcDNA購自上海聯邁生物；CCK-8試劑與凋亡試劑盒購自北京索萊寶；兔抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體與二抗購自美國Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 原代分離培養人骨關節炎軟骨細胞[7]:選取2019年1月至2020年2月于我院接受人工膝關節置換的骨關節炎患者36例，其中男20例，女16例；年齡58～67歲，平均年齡(63.25±4.46)歲。取患者的軟骨組織，在無菌條件下去除多余的纖維結締組織后將其建成1 mm3的組織塊，PBS洗滌，加入0.25%胰蛋白酶消化，于37℃培養箱內培養6 h，收集細胞后用200目濾網過濾細胞，1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，加入DMEM培養基洗滌，將其接種于培養瓶(2.5×105個/ml)，于37℃培養箱內培養至細胞融合度為80%時進行傳代培養。

1.2.2 實驗分組:將軟骨細胞分為Con組、IL-1β組、IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組、IL-1β+GpA-H+pcDNA組、IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組。除Con組外，每組加入10 ng/ml的IL-1β處理24 h[8]。含不同濃度(20、50、100 μg/ml)GpA與10 ng/ml的IL-1β的培養基共同處理IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組的軟骨細胞24 h[9]。pcDNA、pcDNA-TTTY15分別轉染入軟骨細胞后用含有100 μg/ml GpA與10 ng/ml的IL-1β的培養基共同處理24 h。所有轉染步驟按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行操作。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中TTTY15、miR-335-5p的表達水平:用Trizol試劑提取軟骨細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，按照SYBR Green PCR試劑說明書進行qRT-PCR反應，反應程序：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環。TTTY15以GAPDH為內參，miR-335-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算TTTY15、miR-335-5p相對表達量。

1.2.4 ELISA法檢測炎性因子TNF-α、IL-6的水平:收集各組軟骨細胞培養上清液，按照試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6的水平。

1.2.5 檢測氧化應激指標SOD、MDA的水平:收集各組軟骨細胞，采用反復凍融法裂解細胞，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA的水平。

1.2.6 CCK-8實驗檢測細胞存活率:收集各組軟骨細胞接種于96孔板(1×103個/孔)，于培養箱內培養24 h 后每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃培養箱內孵育2 h，用酶標儀檢測各孔OD值并計算細胞存活率。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率:取各組軟骨細胞加入0.25%胰蛋白酶吹打細胞至懸浮狀態，加入500 μl 結合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育15 min，于1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測TTTY15與miR-335-5p的靶向關系:根據TTTY15與miR-335-5p的結合位點構建野生型載體WT-TTTY15，用基因突變技術對TTTY15與miR-335-5p互補序列進行突變而構建突變型載體MUT-TTTY15，熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC或miR-335-5p mimics共轉染至軟骨細胞，24 h后收集細胞并檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達:收集軟骨細胞后提取細胞總蛋白，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將其轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入Bcl-2(1∶800)、Bax(1∶800)一抗與內參GAPDH(1∶1 000)稀釋液4℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，應用凝膠成像分析系統及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子、氧化應激指標的影響 與Con組比較，IL-1β組TNF-α、IL-6、MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組TNF-α、IL-6、MDA的水平降低(P<0.05)，SOD的活性升高(P<0.05)，且GpA不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子、氧化應激指標的影響

2.2 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及凋亡的影響 與Con組比較，IL-1β組細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且GpA不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響；A Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達量；B 細胞凋亡圖

表2 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及凋亡的影響

2.3 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞中TTTY15與miR-335-5p表達量的影響 與Con組比較，IL-1β組TTTY15的表達水平升高(P<0.05)，miR-335-5p的表達水平降低(P<0.05)；與IL-1β組比較，IL-1β+GpA-L組、IL-1β+GpA-M組、IL-1β+GpA-H組TTTY15的表達水平降低(P<0.05)，miR-335-5p的表達水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞中TTTY15與miR-335-5p表達量的影響

2.4 TTTY15靶向調控miR-335-5p TTTY15與miR-335-5p存在結合位點。轉染miR-335-5p mimics可明顯降低野生型載體WT-TTTY15的熒光素酶活性(P<0.05)，而對含有MUT-TTTY15的細胞的熒光素酶活性無明顯影響。與si-NC組比較，si-TTTY15組miR-335-5p的表達水平升高(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-TTTY15組miR-335-5p的表達水平降低(P<0.05)。見圖2，表4、5。

圖2 LncBase Predicted v.2預測顯示TTTY15與miR-335-5p存在結合位點

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 TTTY15靶向調控miR-335-5的表達

2.5 TTTY15過表達可逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子、氧化應激指標的影響 與IL-1β+GpA-H+pcDNA組比較，IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組miR-335-5p的表達水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)。見表6。

2.6 TTTY15過表達可逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及凋亡的影響 與IL-1β+GpA-H+pcDNA組比較，IL-1β+GpA-H+pcDNA-TTTY15組細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3，表7。

表6 TTTY15過表達可逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子、氧化應激指標的影響

圖3 TTTY15過表達可逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖凋亡的影響；A 細胞凋亡圖；B Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達量

表7 TTTY15過表達可逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及凋亡的影響

3 討論

目前從分子水平上分析發現抑制軟骨細胞凋亡及炎性反應成為減緩骨關節炎進展的重要途徑，活性氧分泌量增加可誘發軟骨細胞氧化應激反應及線粒體損傷，氧化應激反應加劇可促使細胞凋亡進而加重軟骨細胞損傷，部分傳統中草藥具有抗氧化、抗炎等作用，并可能作為治療骨關節炎的替代品[10]。但中草藥治療骨關節炎的作用機制尚未闡明。LncRNA在骨關節炎軟骨細胞損傷中表達異常，并可能作為治療骨關節炎的潛在靶點[11]。但LncRNA是否可作為中草藥治療骨關節炎的潛在靶點尚未闡明。

絞股藍總皂苷具有降血脂的作用，還具有抗動脈粥樣硬化的作用[12]。絞股藍總皂苷可通過調控ROS/NF-κB通路而減輕LPS誘導的血管內皮細胞炎癥損傷[13]。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞中TNF-α、IL-6的水平升高，提示成功建立骨關節炎模型。本研究發現隨著絞股藍皂苷A濃度的升高，IL-1β誘導的軟骨細胞TNF-α、IL-6的水平降低，且呈劑量依賴性，提示絞股藍皂苷A可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性反應。軟骨組織損傷可造成局部缺血缺氧導致細胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞發生障礙，進而促使氧自由基大量生成最終促使組織氧化損傷，MDA是一種脂質過氧化產物，而SOD可清除氧自由基而減輕氧化損傷[14]。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞MDA水平升高，SOD活性降低，而絞股藍皂苷A可明顯降低MDA水平而增強SOD活性，提示絞股藍皂苷A可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞氧化應激，且呈劑量依賴性。細胞增殖與凋亡異常可促使軟骨細胞損傷，細胞凋亡涉及多條凋亡信號通路及相關蛋白，當細胞進入凋亡程序時抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低，促凋亡蛋白Bax的表達升高，進一步通過capsase家族蛋白的活化而執行細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高，而Bcl-2蛋白水平降低；隨著絞股藍皂苷A劑量的增高，細胞存活率升高(P<0.05)，而凋亡率降低(P<0.05)，并可抑制Bax表達及促進Bcl-2表達，提示絞股藍皂苷A可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖而抑制細胞凋亡。

為進一步探究絞股藍皂苷A影響骨關節炎軟骨細胞損傷的分子機制，本研究發現IL-1β誘導的軟骨細胞中TTTY15的表達水平升高，而miR-335-5p的表達水平降低，隨著絞股藍皂苷A濃度的增高TTTY15的表達水平降低，而miR-335-5p的表達水平升高，提示絞股藍皂苷A可能通過抑制TTTY15的表達而促進miR-335-5p的表達從而減輕骨關節炎軟骨細胞損傷。研究表明，抑制TTTY15可通過靶向miR-455-5p而減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷[16]。TTTY15通過靶向miR-186-5p促進缺氧誘導的血管內皮細胞損傷[17]。此外，報道指出骨關節炎患者外周血單個核細胞中miR-335-5p的表達下調，其可能是骨關節炎的保護基因之一[18]。miR-335-5p通過靶向c-jun-N端激酶3而改善阿爾茨海默病患者的認知障礙[19]。本研究首次證實骨關節炎軟骨細胞中TTTY15可靶向結合miR-335-5p，并可負向調控miR-335-5p的表達。同時本研究結果顯示，TTTY15過表達后可明顯降低絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥及氧化應激的抑制作用，還可降低細胞存活率而促進細胞凋亡，提示TTTY15過表達可通過負向調控miR-335-5p的表達而部分逆轉絞股藍皂苷A對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥、氧化應激、增殖及凋亡的作用。

綜上所述，IL-1β誘導的軟骨細胞中TTTY15的表達水平升高，而miR-335-5p的表達水平降低，本研究證實TTTY15與miR-335-5p存在靶向關系，絞股藍皂苷A可降低TTTY15的表達水平，而升高miR-335-5p的表達水平，進而抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性反應、氧化應激、凋亡及促進細胞增殖，即TTTY15/miR-335-5p通路可能作為絞股藍皂苷A治療骨關節炎的潛在途徑或靶點，可為揭示骨關節炎的發病機制奠定實驗基礎，還可為骨關節炎的治療提供新方向。