基于PI3K／AKT／mTOR信號通路研究雙氫青蒿素對人肝癌SMMC-7721細胞自噬的影響*

朱海洋，孫會卿，張淑鳳，吳賀文

1.鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450052；2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，發病人數逐年增加，具有極高的發病率及病死率且易復發轉移，預后極差，嚴重危害人類生命健康［1］。自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種分解細胞質等自身構成成分的生理現象，當自噬激活時，自身受損的細胞器及大分子物質被包裹在囊泡中，傳遞至溶酶體進行降解。研究表明，自噬與腫瘤、免疫性疾病及神經退行性疾病等多種疾病的發生發展過程密切相關，在HCC的進展過程中也發揮著重要作用，可促進腫瘤細胞發生凋亡或壞死，抑制腫瘤發展［2-4］。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物，具有水溶性好、吸收迅速、代謝快、不良反應小等優點，除具有抗瘧作用外，還具有抗炎、免疫調節等多方面藥理作用［5-7］。近年來的研究發現，DHA還具有抗腫瘤活性，對肺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞有顯著抑制作 用［8-9］。DHA具 有 誘 導 肝 癌 細 胞 凋 亡 的 作用［10］，但其是否通過調節自噬抑制腫瘤的發生發展尚不清楚。因此，本研究基于PI3K／AKT／mTOR信號通路研究DHA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬的作用，以期為臨床治療HCC提供理論參考。

1 材料

1.1 細胞系人肝癌SMMC-7721細胞，購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號：RKX1036。細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中，37℃、5%CO2培養箱內常規培養。選擇生長狀態良好的細胞，加入凍存培養基，置于-80℃冰箱，第2天轉至液氮中保存。

1.2 藥物與試劑雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA，成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞98%，貨號：S-102）。胎牛血清、青霉素（純度≥97%）、鏈霉素（純度≥98%）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、MTT、二甲基亞砜、戊二醛溶液（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：12103C、19532、85886、189490、M2128、D5879、G5882）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號：25200072）；乙醇（純度≥99.5%）、丙醇（純度≥99.9%）、檸檬酸鉛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：E111994、P110345、L303843）；細胞自噬染色試劑盒（MDC法）、ECL化學發光法檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G0170、SW2020）；胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1，美國Biovision公司，貨號：7507-20）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，貨號：R21250-250T）；兔抗人磷脂肌酰醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）單抗、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）多抗、p-AKT多抗、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）單抗、p-mTOR單抗、Beclin1單抗、微管相關蛋白輕鏈3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）單抗和HRP標記的山羊抗兔IgG（美國Abcam公 司，貨 號：ab278545、ab8805、ab38449、ab134903、ab109268、ab210498、192890、ab150077）。

1.3 儀器MZDH0850型顯微鏡（美國Lignomat公司）；IX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Avanti J-E型高速離心機（美國Beckman公司，離心半徑：8 cm）；JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；E-Gel Imager凝膠成像儀（美國Invitrogen公司）；DYY-4C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養取常規凍存的人肝癌SMMC-7721細胞，復蘇，培養于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于體積分數5% CO2的培養箱內37℃恒溫培養。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細胞抑制率取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100μL，常規培養待細胞貼壁后，棄去培養基，加入含有不同濃度（0μmol·L-1、6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）DHA的培養基，每個濃度設置5個復孔，分別培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，充分震蕩后，用酶標儀在490 nm處讀取光密度（optical density，OD）值，計算細胞抑制率，繪制細胞增殖抑制曲線，計算半抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50），即抑制50%細胞生長時的DHA濃度，并將此濃度用于后續的實驗研究。

細胞增殖抑制率＝（1-實驗組OD值／對照組OD值）×100%

2.3 細胞形態學觀察取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100μL，待細胞貼壁后，棄去培養基，加入“2.2項”中不同濃度DHA，培養48 h后，顯微鏡下觀察細胞形態變化，并拍照記錄。

2.4 透射電鏡觀察細胞自噬取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×106mL-1，取10 mL細胞懸液，接種于直徑90 mm的培養皿中，隨機分為對照組、DHA組、抑制劑組和激動劑組，待細胞貼壁后棄去培養基，DHA組細胞以IC50劑量的DHA進行干預，抑制劑組加入含有IC50劑量的DHA+5 mmol·L-1的3-MA（PI3K的抑制劑）的培養基，激動劑組加入含有IC50劑量的DHA+100μg·L-1IGF-1（AKT的激動劑）的培養基，對照組采用常規培養基培養。培養48 h后，收集細胞，1 000 r·min-1離心10min，棄去培養液，加入2.5%的戊二醛溶液4℃固定72 h，1%四氧化鋨固定30 min，梯度乙醇和丙醇脫水，樹脂包埋，切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色，置于電鏡下觀察細胞自噬情況。

2.5 MDC染色觀察細胞自噬取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×105mL-1，接種于6孔板，每孔2.5 mL，常規培養，待細胞貼壁后，分為對照組、DHA組、抑制劑組和激動劑組，按“2.4項”下所描述的方法處理細胞，培養48 h后，棄去培養液，1×wash buffer洗滌，每孔加入100μL MDC染液，室溫避光染色45 min，離心收集細胞，1×wash buffer洗滌2次后，每孔滴加50μL抗淬滅封片液封片后4℃避光保存，熒光顯微鏡下（激發波長355 nm、阻斷波長512 nm）觀察細胞自噬情況。

2.6 Western Blot檢測細胞中PI3K／AKT／m TOR信號通路相關蛋白及自噬相關蛋白的表達水平取對數生長期細胞，調整細胞密度為1×106mL-1，接種于培養瓶中，每瓶5mL，待細胞貼壁后，分為DHA組、抑制劑組、對照組和激動劑組，按“2.4項”下所描述方法處理細胞，培養48 h后，收集細胞。加入細胞裂解液，離心取上清，按照BCA蛋白測定試劑盒說明書要求測定蛋白濃度，校正上樣量，加入SDS上樣緩沖液，100℃水浴15 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結束后，轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，TBST洗膜3次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜2次，每次5 min，加入PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、Beclin1、βactin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，根據ECL化學發光試劑盒說明書滴加發光液，曝光顯影后采用凝膠成像分析系統進行灰度掃描。以目的蛋白灰度值與內參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

2.7 統計學方法采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 DHA對SMMC-7721細胞增殖的影響與0μmol·L-1組比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細胞后，細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與24 h比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細胞48 h、72 h后，細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與48 h比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細胞72 h后，細胞增殖抑制率無明顯差異（P＞0.05）。根據細胞增殖抑制曲線，DHA干預SMMC-7721細胞24 h、48 h、72 h時的IC50值分別為（36.26±4.67）μmol·L-1、（49.68±6.01）μmol·L-1、（71.24±7.79）μmol·L-1。其中，50μmol·L-1DHA作用SMMC-7721細胞48 h時，對細胞的增殖抑制率接近48 h時的IC50值，因此，后 續 實 驗 選 取50μmol·L-1DHA干 預SMMC-7721細胞48 h進行相關指標的檢測。見圖1。

圖1 DHA對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用

3.2 不同濃度DHA對SMMC-7721細胞形態的影響0μmol·L-1組細胞形態正常，呈長梭形；其余各濃度DHA作用于細胞后，細胞逐漸失去原有形態，變短變圓，且隨著濃度增加，變形細胞數目增加，細胞邊緣模糊不清，不貼壁，懸浮于培養液中。見圖

2。

圖2 不同濃度DHA對SMMC-7721細胞形態的影響（×400）

3.3 透射電鏡觀察DHA對SMMC-7721細胞自噬的影響對照組可見內質網、溶酶體、高爾基復合體等正常細胞器，未見自噬泡；DHA組和抑制劑組可見圓形、大小不一、包裹細胞器或胞漿的自噬泡（箭頭標注），細胞發生明顯自噬；激動劑組細胞器清晰，可見少量自噬泡，細胞自噬程度較輕。提示DHA可誘導SMMC-7221細胞自噬，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA誘導的SMMC-7221細胞自噬，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA誘導的SMMC-7221細胞自噬。見圖3。

3.4 MDC染色觀察DHA對SMMC-7721細胞自噬的影響熒光顯微鏡下發現，對照組熒光強度較弱；DHA組和抑制劑組出現大量綠色熒光，熒光強度明顯增強，細胞發生明顯自噬；激動劑組熒光減弱，細胞自噬程度減輕。提示，DHA可促進SMMC-7221細胞自噬，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA誘導的SMMC-7221細胞自噬，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA誘導的SMMC-7221細胞自噬。見圖4。

圖4 MDC染色觀察DHA對SMMC-7721細胞自噬的影響（×200）

3.5 DHA對SMMC-7721細胞中PI3K／AKT／m TOR信號通路相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響與對照組比較，DHA組、抑制劑組、激動劑組PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與DHA組、抑制劑組比較，激動劑組PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）。提示，DHA可抑制SMMC-7221細胞中PI3K／AKT／mTOR信號通路激活，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA對PI3K／AKT／mTOR信號通路的激活，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA激活PI3K／AKT／mTOR信號通路。見表1，圖5，圖6。

圖5 SMMC-7721細胞中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR的蛋白表達比較

表1 SMMC-7721細胞中各蛋白表達水平比較 （±s，n＝5）

表1 SMMC-7721細胞中各蛋白表達水平比較 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與DHA組比較，b P＜0.05；與抑制劑組比較，c P＜0.05

／LC3-I Beclin1對照組 0.68±0.07 0.86±0.09 0.51±0.07 0.92±0.09 0.5組別 PI3K AKT p-AKT mTOR p-mTOR LC3-Ⅱ9±0.06 0.25±0.05 0.19±0.04 DHA組 0.26+0.05a 0.87±0.08 0.15±0.04a 0.87±0.08 0.23±0.04a 1.23±0.09a 0.58±0.06a抑制劑組 0.21±0.04a 0.85±0.08 0.11±0.04a 0.83±0.08 0.21±0.04a 1.25±0.10a 0.55±0.05a激動劑組 0.55±0.06abc 0.88±0.09 0.38±0.05abc 0.93±0.09 0.46±0.05abc 0.82±0.09abc 0.38±0.04 abc

注：A：對照組；B：DHA組；C：抑制劑組；D：激動劑組

4 討論

HCC是致死率最高的惡性腫瘤之一，目前臨床上主要治療手段為手術治療及輔助放化療，但是由于HCC復發率高、放化療易使腫瘤細胞產生耐藥性，導致HCC的預后極差［11-12］。因此，研究HCC的發病機制，尋找高效、低毒、安全的抗癌成分是臨床工作者亟待解決的問題。

近年來的研究顯示，從傳統中草藥青蒿中提取出的天然抗癌成分，在緩解患者臨床癥狀、延緩病情方面療效顯著［13-14］。DHA是青蒿素的一種衍生物，能參與抑制腫瘤細胞增殖的多個環節，可通過抑制細胞增殖、誘導凋亡、介導細胞生長周期阻滯等發揮抗腫瘤活性［15-16］。同時，DHA的抗腫瘤活性還表現在誘導腫瘤細胞自噬，抑制細胞增殖等方面［17-18］。本研究采用不同濃度DHA作用于人肝癌SMMC-7721細胞發現，隨著DHA濃度升高，細胞增殖抑制率升高，細胞形態發生明顯改變，提示DHA對SMMC-7721細胞具有明顯的增殖抑制作用。

自噬是細胞的一種自我分解代謝過程，是應急情況下維持細胞內環境穩定及代謝平衡的重要機制，其功能改變或缺失與腫瘤發生密切相關［19］。研究發現，自噬對HCC的發生發展表現出促進和抑制的雙重作用，一方面，自噬可在HCC起始階段抑制腫瘤發生發展；另一方面，自噬可在HCC發展過程中為腫瘤細胞提供營養，促進細胞增殖［20-21］。研究表明，DHA在細胞自噬過程中發揮重要作用，可誘導人臍靜脈內皮細胞、人舌鱗狀細胞癌細胞及膽管癌細胞系發生自噬，促進細胞凋亡［22-24］。本研究透射電鏡觀察發現，DHA組可見較多的自噬泡；同時MDC染色顯示，DHA組熒光強度最強，提示DHA具有誘導SMMC-7721細胞自噬的作用。

自噬的發生由多種基因和蛋白通過多條信號通路共同發揮調控作用，其中PI3K／AKT／mTOR信號通路是負性調控自噬的經典途徑，與多種腫瘤的發生發展有關。PI3K在自噬早期發揮重要作用，不同細胞因子刺激可導致PI3K被激活，進一步活化AKT，使AKT發生磷酸化，之后將信號傳至mTOR，觸發mTOR磷酸化，從而激活PI3K／AKT／mTOR信號通路，調控下游相關因子，對細胞自噬發揮抑制作用［25］。LC3是自噬體的標記蛋白，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種剪切形式，自噬發生時LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，LC3-Ⅱ是發生自噬的標志性蛋白，二者比值與自噬程度有關。Beclin1是自噬體形成過程中的必需分子，調控自噬體的形成與成熟。mTOR通過影響自噬體的形成，對自噬起負調控作用，PI3K蛋白可與Beclin-1形成復合物，參與溶酶體的形成，調控自噬。本研究發現，采用PI3K特異性抑制劑3-MA預處理細胞后，與對照組比較，細胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達水平顯著升高，PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平顯著下降；采用AKT特異性激動劑IGF-1預處理細胞后，細胞LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達水平顯著下降，PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平上升，表明PI3K／AKT／mTOR信號通路參與SMMC-7721細胞自噬。研究表明，miR-27a可通過靶向抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路，促進骨關節炎關節軟骨細胞的自噬和凋亡［26］。另外，抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路，可促進自噬，減弱卵巢癌細胞惡性生物學特性［27］。本研究發現，DHA組細胞LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白表達水平顯著下降，PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達水平上升，與抑制劑組效果一致，而與激動劑作用相反，提示，DHA可能是通過抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路發揮促進細胞自噬的作用。

綜上所述，DHA可誘導人肝癌SMMC-7721細胞自噬，抑制細胞增殖，其機制可能與抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路有關，為臨床治療HCC提供一定理論參考。