黃芪甲苷對局灶性腦缺血后適應中Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子表達的影響*

徐玥瑋， 王麗， 高曉明， 謝若男， 王雷， 楊滿琴**

(1.安徽中醫藥大學第二附屬醫院 藥學部， 安徽 合肥 230061； 2.安徽中醫藥大學 藥學院， 安徽 合肥 230061)

缺血性卒中是中樞神經系統的常見血管疾病，是全球致殘和死亡的主要原因。血管再通可以補充血管中的營養物質和氧氣，并去除有毒代謝物，是缺血性卒中的主要的治療方法[1]。然而，缺血再灌注損傷能激活壞死、凋亡、自噬等一系列細胞死亡程序，常導致嚴重的神經功能障礙[2]。因此，尋找有效的緩解缺血再灌注損傷的方法是臨床上急需解決的問題。缺血后適應即在長期嚴重的腦缺血后，在再灌注開始前應用反復短暫性灌注的方法被證明可緩解腦缺血再灌注后造成的損傷[3]。Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)是高度保守的信號通路，廣泛存在于多細胞真核生物中，并與細胞多種生理和病理過程密切相關[4]。有研究表明，Wnt/β-catenin在腦、腎、肝臟等器官的缺血再灌注損傷中起保護作用[5]。同時Wnt蛋白廣泛存在于腦血管和血腦屏障中，參與腦血管的形成和血腦屏障分化，在血腦屏障的形成和維持、腦血管的再生和重塑中也起到重要的作用[6]。有研究表明，腦損傷時，多種藥物通過介導Wnt/β-catenin信號通路誘導神經保護、促進神經發生，進而減輕腦血腦再灌注損傷[5，7-8]。但目前Wnt/β-catenin對腦缺血后適應的調節作用尚不清楚。黃芪甲苷是從中藥黃芪中提取的最有生物活性的單體，研究表明黃芪甲苷具有很強的神經保護作用[9]，黃芪甲苷可通過減弱氧化應激損傷、抑制細胞凋亡、促進血管重構和再生等途徑對多器官的缺血再灌注損傷起保護作用[10]。 研究發現，黃芪甲苷可激活Wnt/β-catenin信號通路促進卒中小鼠的神經發生并減輕認知障礙[11]，本研究旨在探討黃芪甲苷通過調節Wnt/β-catenin對腦缺血后適應的影響及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪甲苷購自阿拉丁公司，尼莫地平購自美侖生物，大鼠源高敏c反應蛋白(high-sensitivity C-Reactive Protein，hs-CRP)ELISA試劑盒購買自Elabscience公司，大鼠源S100鈣結合蛋白B(S100 calcium binding protein B，S100-B)ELISA試劑盒購自優爾生公司，PCR相關試劑均購自BioTeke公司，Wnt家族成員3A(Wnt3a)、β-catenin、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)抗體購自萬類生物，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1實驗動物及分組 SPF級SD雄性大鼠，6～8周齡，體質量260～320 g。適應性喂養1周后，隨機分為7組：假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、缺血后適應組(IPC組)、中藥單體黃芪甲苷(低，10 mg/kg)+缺血后適應組(IPC+AS-IV10組)、中藥單體黃芪甲苷(中，20 mg/kg)+缺血后適應組(IPC+AS-IV20組)、中藥單體黃芪甲苷(高，50 mg/kg )+缺血后適應組(IPC+AS-IV50組)、尼莫地平+缺血后適應組(IPC+Nim組)，每組12只大鼠。Sham組僅暴露頸總動脈，不進行線栓阻斷及缺血-再灌注處理。I/R組建模方式參照文獻[12]的方法，具體步驟如下：大鼠予10%水合氯醛腹(4 mL/kg)腔注射，麻醉后仰臥固定，頸部正中切口約4 cm，暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈；動脈夾夾閉右側頸總動脈，在靠近頸內外動脈分叉處的頸外動脈斜形切口，將帶有圓形尖端的4-0單絲尼龍縫線通過頸外動脈殘端插入頸內動脈，并輕輕推進以阻塞大腦中動脈內，使其閉塞2 h后(缺血)，拆除縫線恢復血流(復流)；IPC組在大腦中動脈閉塞2 h后，復流30 s后再缺血30 s，完成“復流30 s—缺血30 s”3個循環，然后拆除縫線恢復血流；IPC+AS-IV10、IPC+AS-IV20、IPC+AS-IV50組在造模前分別按10、20、50 mg/kg劑量給予黃芪甲苷連續灌胃7 d，于末次灌胃后2 h進行IPC手術；IPC+Nim組在IPC術前給予尼莫地平(10 mg/kg)連續口服15 d，于末次灌胃后2 h進行IPC手術。

1.2.2神經功能評估 手術24 h后，對大鼠進行神經功能學評估[13]，沒有神經損傷體征計0分，不能完全伸直對側前爪計1分，身體向偏癱側轉圈計2分，身體向對側傾倒計3分，不能自發行走、意識喪失計4分。

1.2.3計算腦梗死面積 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TCC)染色檢測腦梗死面積。所有大鼠神經功能學評估完成后處死并取出腦組織，在-20 ℃冰箱冷凍1～2 h，去除嗅球、小腦后將大腦冠狀面平均切分為5片，將腦片后放入1 %TTC溶液中，37 ℃染色10～15 min，期間注意避光并不斷的翻動切片使之染色均勻，染色結束后擺齊，拍照并軟件計算梗死區面積。

1.2.4腦組織學觀察 大鼠腦組織4 %多聚甲醛固定后，石蠟包埋后切成5 μm薄片、行HE染色[14]，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5血清hs-CRP、S100-B水平檢測 ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清hs-CRP、S100-B(腦組織損傷標記物)水平，分別按照hs-CRP、S100-B商品化試劑盒說明術操作步驟處理血清，通過酶標儀測定450 nm的OD值，以OD值為橫坐標，標準品濃度為縱坐標，根據標準曲線計算出各樣本濃度。

1.2.6腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA檢測 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA表達。使用TRIpure RNA試劑提取腦組織的總RNA，并通過紫外分光光度計NANO 2000測定RNA濃度，然后用Super M-MLV 反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，通過ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析，按2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequencing information

1.2.7腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin的蛋白檢測 免疫印跡檢測Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin蛋白表達。取適量大鼠腦組織，使用全蛋白提取試劑盒抽提細胞蛋白并用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，取蛋白樣品進行丙烯酰胺凝膠電泳并轉印至聚偏二氟乙烯膜，將Wnt3a(1 ∶500)、β-catenin(1 ∶400)、BDNF(1 ∶1 000)和p-β-catenin(1 ∶1 000)相應一抗分別放入封閉液中，4 ℃孵育過夜，之后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000)，37 ℃孵育45 min，最后用ECL化學發光試劑使底物發光。用凝膠圖象處理系統分析目標條帶的光密度值，以β-actin做內參。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠神經功能評分

Sham組大鼠神經功能學評分為0分，未見神經功能損傷的癥狀。與Sham組相比，I/R組大鼠復流24 h后神經功能損傷評分上升(P<0.05)；與I/R組相比，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組大鼠神經功能學評分降低(P<0.05)；與IPC組相比，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠神經功能學評分降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 大鼠腦梗死面積

Sham組腦組織沒有白色梗死組織，I/R組可見明顯白色梗死組織(P<0.05)。與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組白色梗死組織減少(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組白色梗死組織減少(P<0.05)；但IPC+Nim組與IPC+AS-IV50組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 大鼠腦組織學觀察

Sham組大鼠腦組織形態正常，染色均一；I/R組大鼠腦組織細胞明顯減少，無法分清各層，大部分神經元出現變性、壞死，大量神經元細胞出現核固縮，部分核仁消失，胞體變形，出現嚴重空泡樣變。IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組出現異形、核固縮的細胞數量不同程度的減少，及輕微細胞水腫。IPC+Nim組正常細胞數量較I/R組明顯增多，僅有少量的空泡樣變。見圖3。

2.4 大鼠血清S-100B、hs-CRP含量

I/R組大鼠血清中S-100B、hs-CRP含量明顯高于Sham組(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin以及BDNF mRNA表達

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平降低(P<0.05)。與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組以及IPC+Nim組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平升高(P<0.05)。與IPC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠腦組織中BDNF、Wnt3amRNA升高(P<0.05)，IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠腦組織中β-cateninmRNA升高(P<0.05)。此外，大鼠腦組織中Wnt3a、β-cateninmRNA的表達呈現黃芪甲苷劑量依賴；與IPC+AS-IV20組比較，IPC+AS-IV50組Wnt3amRNA的表達升高(P<0.05)；IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組間比較，β-cateninmRNA的表達隨劑量增高而升高(P<0.05)。見圖5。

2.6 大鼠腦組織Wnt3a，β-catenin以及BDNF蛋白的表達

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中Wnt3a，β-catenin和BDNF蛋白的表達均降低(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的Wnt3a、β-catenin和BDNF蛋白水平升高(P<0.05)。與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組Wnt3a蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50組的Wnt3a蛋白水平高于IPC+AS-IV20組(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組β-catenin蛋白水平增高(P<0.05)，且IPC+AS-IV50組的β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV10組(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組BDNF蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50組的BDNF蛋白水平高于IPC+AS-IV10組(P<0.05)。與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中p-β-catenin蛋白表達升高(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)；與PIC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)，且IPC+AS-IV20組p-β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV50組(P<0.05)。見圖6。

3 討論

近年來，缺血性卒中的治療方法不斷發展，但及時溶栓處理恢復血管血氧供應一直是治療缺血損傷的標準方法。然而血管再通后，隨之而來的是血小板過度活化、微血管損傷、氧化應激、細胞內鈣超載以及過度炎癥反應，因而對受損的腦組織造成第二次損傷即缺血再灌注損傷。在臨床治療上，缺血再灌注損傷的程度與患者的死亡率和致殘率密切相關。因此全面了解缺血再灌注損傷、抑制或減輕缺血再灌注損傷對提高再灌注治療的有效性有關鍵作用[15]。缺血后適應是恢復冠狀動脈血流灌注前給予反復幾次短暫灌注可明顯減輕再灌注損傷，并有研究表明，與缺血再灌注相比，缺血后適應對局灶性腦損傷具有一定的神經保護效應[16]。

中藥單體黃芪甲苷是中藥黃芪中的有效成分，現代藥理研究表明，黃芪甲苷對多種缺血再灌注、心血管疾病、肺部疾病、肝纖維化和糖尿病腎病等均有保護作用[17-18]。近年來，已有多項研究表明，黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷有保護作用[19]。本研究中，采用大鼠I/R模型，在大鼠腦缺血后給予缺血后適應處理，結果表明，再灌注前進行缺血后適應處理有效的減少了大鼠腦梗死面積，并降低了大鼠神經功能學評分，表現出神經保護效應。本研究探討中藥單體黃芪甲苷聯合缺血后適應對大鼠I/R損傷的神經保護作用，給予IPC大鼠不同劑量的黃芪甲苷后，大鼠腦梗面積和神經功能損傷程度明顯減少。但是黃芪甲苷聯合缺血后適應的治療在腦缺血再灌注損傷中神經保護作用及其分子機制尚不清楚。

研究表明，黃芪甲苷可以通過Wnt/β-catenin信號刺激細胞成骨分化，揭示出黃芪甲苷對Wnt/β-catenin通路的調控作用[20]。但是黃芪甲苷聯合缺血后適應處理緩解I/R損傷的神經保護作用是否通過Wnt/β-catenin通路尚不明確。Wnt是參與胚胎和腫瘤發生的關鍵信號，并維持成年期的神經元穩態。Wnt/β-catenin是Wnt通路中經典的信號通路，是神經元發育和維持穩態的重要的信號通路，在Wnt缺失的情況下，細胞質內的GSK-3β與Axin和APC等以復合物的形式p-β-catenin并使其降解，Wnt通路關閉。當Wnt配體蛋白與細胞表面受體FZD、卷曲蛋白LRP5/6結合時，觸發細胞內的信號轉導，Wnt/β-catenin信號通路被激活，隨后抑制β-catenin的磷酸化，從而促進β-catenin的穩定。穩定的β-catenin易位到細胞核內，與T細胞因子TCF相互作用，提高促細胞存活的關鍵因子表達[21]。腦源性神經營養因子BNDF是在神經系統中廣泛表達的具有神經營養作用的蛋白質，BNDF的表達水平與認知功能呈正相關性。因此本研究采用了RT-PCR和Western Blot分別檢測大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin和BNDF mRNA及蛋白的表達，探究黃芪甲苷處理后對Wnt/β-catenin的調控作用，并以BNDF的表達反映黃芪甲苷調控Wnt/β-catenin對腦損傷的恢復功能。結果顯示缺血后適應以及黃芪甲苷聯合缺血后適應處理不同程度的上調了Wnt家族中重要蛋白Wnt3a及下游β-catenin的表達，并上調了BNDF的表達。

總之，本研究揭示了缺血后適應處理有助于緩解缺血再灌注造成中樞神經系統的神經元損傷；黃芪甲苷可以促進缺血后適應處理對局灶性腦損傷腦保護作用。本研究發現，黃芪甲苷聯合缺血后處理可上調Wnt3a、β-catenin和BNDF的表達，這些影響可能通過Wnt3a/β-catenin信號通路調節大鼠再灌注損傷。