Caspase12和Caspase3在內質網應激介導的HCC細胞凋亡中的作用*

溫靜靜， 董玉娟， 王大壯， 王世凱， 陳紅芳

(1.濰坊市益都中心醫院 病理科， 山東 濰坊 262500； 2.濰坊市益都中心醫院 肝膽外科， 山東 濰坊 262500)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一類死亡率較高的原發性肝癌，是起源于肝細胞的惡性腫瘤，對人類健康形成了極大威脅，尋找有效治療方法的研究一直備受關注[1]。有研究發現，未經治療的HCC會發生自發性癌細胞凋亡[2]，且惡性程度越高凋亡指數越大[3]，提示通過調控HCC組織的細胞凋亡可對HCC的治療成為可能。研究認為，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通過調控多種細胞信號通路介導了腫瘤組織細胞凋亡的發生發展[4-7]，葡萄糖調節蛋白78(GRP78)常常作為細胞發生ERS的標志，當ERS發生時，GRP78與內質網(ER)膜上3種跨膜蛋白解離而啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)等相關級聯反應，誘導細胞凋亡[8]。Caspase家族成員被公認在細胞凋亡信號轉導中發揮中心作用，尤其是Caspase3作為細胞凋亡執行者，其激活機制的研究對于調節細胞凋亡的發生有著重要意義[9]。Caspase12是特定于內質網外膜上的促凋亡分子，在發生ERS相關凋亡過程中，Caspase12活化是其核心環節之一[10]，本文研究ERS介導的HCC細胞凋亡過程中，Caspase3與Caspase12的表達水平的變化，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 標本和臨床資料來自醫院病理分級為Ⅰ-Ⅱ級(高分化)、Ⅲ-Ⅳ級(低分化)HCC組織標本各25份，總共50份標本中隨機選取25份HCC標本的癌旁組織(距病灶2 cm的組織)作為癌旁對照組，標本均為2018—2019年手術病人切除的組織，-80 ℃速凍保存。男29例、女21例，年齡33～78歲、平均62歲。相關標本采集及使用符合人體標本研究相關倫理學要求。

1.1.2主要試劑 GRP78、Caspase3、Caspase12抗體，免疫組化Envision二抗檢測試劑盒、原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒、Millipore NC膜0.45 μm孔徑均購自北京Bioss技術有限公司，SYBRGreen購自大連TaKaRa公司，Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液購自美國賽墨飛世兒科技公司，逆轉錄試劑盒購自加拿大富酶泰斯公司，GRP78、Caspase3、Caspase12和β-actin引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下見表1。

表1 不同目的基因引物序列Tab.1 Primer sequences of different target genes

1.2 研究方法

1.2.1肝組織病理學檢查 肝組織采用10%福爾馬林固定、乙醇脫水并進行組織石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色后觀察肝臟組織病理變化。

1.2.2TUNEL法檢測肝組織中肝細胞凋亡 按照試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察凋亡的細胞，以胞核發綠色熒光的細胞作為凋亡細胞，并計算凋亡指數。凋亡指數=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.2.3免疫組化檢測肝組織中GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表達 組織標本常規脫蠟水化，去離子水孵育后，分別滴加GRP78、Caspase3及Caspase12抗體(濃度比均為1 ∶100)，4 ℃過夜，次日37 ℃二抗孵育0.5 h，DAB顯色，蘇木素復染，磷酸鹽緩沖液處理作為陰性對照，計算陽性細胞百分比(N)，N=(n陽/n總)×100%。(n陽為顯微鏡下隨機抽取5個視野觀察胞漿黃染的細胞，n總為5個視野觀察細胞總數)。

1.2.4Real-time PCR檢測GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表達 采用雙股DNA結合熒光系統(SYBRGreen)，按Thermo K1622逆轉錄反應試劑盒規范操作，20 μL逆轉錄反應體系為總RNA 1.0 μg、5×PCR Buffer 4.0 μL、dNTP 2.0 μL、Oligod(T) 1.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、MMLV反轉錄酶1.0 μL、無RNA酶H2O補足體積，反應條件為25 ℃ 10 min、48 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min；25 μL Real-time PCR反應體系為2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、Cdna 2.0 μL、無RNA酶H2O 8.5 μL，反應條件為預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環。每個樣本設置2個復孔，實驗重復3次，mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5Western Blot法檢測肝組織中GRP78、Caspase3及Caspase12 蛋白表達 將制備好的蛋白樣品每孔加樣 8.0 μL。膜孔徑轉膜，制作濕式轉膜“三明治”；用封閉液(脫脂奶粉)室溫封閉90 min，將鼠抗GRP78、Caspase3及Caspase12分別按照1 ∶800、1 ∶1 000、1 ∶1 000比例稀釋，4℃孵育過夜，搖床速度20～30次/min。次日回收一抗，TBST洗膜，6 min×3 次，二抗稀釋液稀釋二抗，抗兔IgG抗體(1 ∶20 000)常溫孵育60 min，采用ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 HCC組織病理學變化

HE染色顯示，HCCⅠ-Ⅱ級組HCC癌細胞呈細梁索狀排列，細胞輕度異型，胞漿豐富，輕度嗜堿性，胞核大，核漿比值增大，核仁明顯，少量核分裂象；HCCⅢ-Ⅳ級組HCC癌細胞呈粗梁索狀或雜亂排列，細胞異型明顯，細胞核大、不規則，核分裂象易見，查見巨核或怪狀核；癌旁組織肝細胞索排列規則。見圖1。

2.2 細胞凋亡

TUNEL法檢測各組標本的細胞凋亡情況，結果表明HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中細胞凋亡的數目明顯增加，與癌旁對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表達

免疫組化檢測結果顯示，GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白主要在細胞漿中，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組標本中Caspase3及GRP78的表達較癌旁組織增多(P<0.05)；在癌旁對照、HCCⅠ-Ⅳ級、Ⅲ-Ⅳ級組中，Caspase12表達未見明顯差異(P>0.05)。見圖3、圖4。Western Blot檢測結果顯示，與癌旁對照組相比，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中GRP78、Caspase3蛋白表達增加(P<0.05)，而各組標本的Caspase12蛋白比較，差異無統計學意義 (P>0.05)。見圖5。

2.4 GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表達

結果顯示，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中Caspase3及GRP78 mRNA的表達水平較癌旁對照組織增多(P<0.05)；在各組組織中Caspase12 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

3 討論

HCC因高發病率、高死亡率備受各學者關注，其發病機制與機體乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和脂肪性肝炎、酒精性肝炎等慢性炎癥相關[11-12]。各種理化生物因素作用細胞后出現炎癥及氧化應激損傷甚至對基因產生影響，進而直接或間接引發ERS[13]。ERS是一種信號反應通路系統，是細胞的一種保護機制[14]。生理狀態下，內質網膜上的3類跨膜蛋白，即蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK) 、1型內質網轉膜蛋白激酶(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)，與GRP78(BiP)結合，處于失活狀態[15-16]；當發生ERS時，3條信號通路相繼被激活。早期內質網應激是促生存響應，過強或持續時間過長的未折疊蛋白反應會促進增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達引起細胞凋亡[17-18]，除CHOP介導細胞凋亡外，JNK信號通路及Caspase12通路也可介導凋亡[19-20]，Caspase12是由ERS誘導細胞凋亡的調節蛋白，由內質膜轉位到細胞質，對Casase9酶原進行切割以使之活化，進而順序激活Caspase3等效應Caspasese[21-22]。關于HCC發生發展過程中受內質網應激介導，是否激活Caspase12誘導的細胞凋亡通路的研究少有報道。

本研究發現，無論高分化還是低分化HCC組織的細胞凋亡均明顯高于癌旁組織，說明HCC的發生伴隨有細胞凋亡的增加，與其他研究報道一致。同時，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中GRP78 mRNA和蛋白表達與癌旁組織比較均有增多，表明在HCC組織細胞凋亡增加的同時，細胞發生了內質網應激也是增強的，因此說明ERS介導了HCC細胞凋亡的發生；而Caspase3在HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中mRNA和蛋白表達與癌旁肝組織比較有顯著增高，并且HCC Ⅰ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中細胞凋亡比例隨著惡性程度的升高而增加，從而進一步表明ERS介導HCC細胞凋亡是通過調節相關信號通路從而激活Caspase3執行細胞凋亡的可能。但本研究還發現，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中Caspase12 mRNA和蛋白表達與癌旁肝組織比較無顯著變化，提示人HCC細胞凋亡發生且Caspase3的激活是ERS介導Caspase12以外的信號通路進行的，與前期在動物模型水平研究發現有所不同[23]，結合其他研究報道分析，Caspase12作為ERS中啟動凋亡程序的一種特異蛋白酶，在以嚙齒類動物為代表的的其他動物體內表達發揮重要作用，而在人體中Caspase12可能因喪失其酶活性不能發揮信號轉導調節作用[24-25]。因此推測人體HCC發生細胞凋亡過程中，作為核心環節的Caspase3活化是ERS介導Caspase12以外的信號轉導途徑所致。

綜上所述，在HCC發生發展過程中，ERS誘導的細胞凋亡參與其中，并且是通過Caspase12以外信號轉導途徑激活Caspase3實現的，這為今后尋找有效調節細胞凋亡從而發揮治療HCC的研究拓寬了思路，并提供了一定的理論依據。