基于網絡藥理學與實驗研究探討β-葡聚糖治療S180腹水瘤的作用機制

楊文卿，姜濤，程路峰*（. 新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 8300；. 新疆醫學動物模型研究重點實驗室，烏魯木齊 8300）

近年來，癌癥的發病率逐年升高[1]。有研究發現2018年全球新發癌癥人數達1810萬，我國占24%（約430萬）[2]。目前對于腫瘤的治療以免疫治療與靶向治療為主，但治療過程中易產生耐藥、副作用大等問題[3]。

天然多糖為結構多樣的生物大分子，從不同的植物、動物以及微生物中分離得到，在抗氧化[4]、抗凝血[5]、抗腫瘤[6]及刺激免疫[7]等方面表現出良好的活性。多種食用菌多糖已在體內外體現出明顯的抗腫瘤及免疫調節作用[8-9]。本研究利用網絡藥理學方法，以β-葡聚糖與腹水瘤作為研究對象，預測相關靶點及通路，并建立相關模型對其進行實驗驗證，以闡述其抗腫瘤的作用機制。

1 材料

1.1 軟件與數據庫

β-葡聚糖靶點的預測：Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）；疾病靶點的獲?。篏een Cards數據庫（https：//www.genecards.org）；OMIM數據庫（https：//omim.org）。靶點間相互作用關系分析：String網站（https：//string-db.org）。相關關系圖的繪制：Draw Veen網站（http：//bioinfornatics.psb.ugent.be/webtools/Veen/）?；プ骶W絡圖的繪制：Cytoscape 3.8.0軟件。相關通路分析：R Studio 3.6.3軟件。

1.2 細胞株與實驗動物

S180細胞（中喬新舟細胞庫）；C57小鼠，雌鼠體質量20～23 g；雄鼠體質量28～31 g，SPF級[新疆醫科大學實驗動物中心，合格證編號：SCXK（新）2018-0002]。

1.3 試藥

β-葡聚糖（S24487，上海源葉）；順 鉑（IC0440，索萊寶公司）；胎牛血清（FBS10099-141，Gibco）；RPMI1640培養基（AE29163439，Hyclone）；雙抗鏈霉素混液（Gibco）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；小鼠白細胞介素（IL）-2、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（鈺博生物有限公司）。Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、JAK2、STAT3兔抗小鼠抗體（Abcam）；山羊抗兔二抗（Bioss，bs-40295G-HRP）。

1.4 儀器

光學顯微鏡、3-18K離心機（Sigma）；蛋白電泳儀及轉印儀（Bio-Rad）；凝膠圖像分析軟件。

2 方法

2.1 β-葡聚糖及腹水瘤疾病靶點預測

采用Swiss Target Prediction對β-葡聚糖作用靶點進行預測，使用Geen Cards與OMIM數據庫預測腹水瘤疾病靶點。

2.2 β-葡聚糖抗腫瘤作用靶點預測與Network網絡圖的構建

將上述β-葡聚糖作用靶點與抗腫瘤相關靶點導入Veen數據庫進行交互分析，將藥物作用靶點與Veen圖中交集靶點導入Cytoscape 3.8.0，獲得藥物-疾病-靶點相互作用網絡圖。

2.3 蛋白互作、GO與KEGG分析

將交互靶點導入String數據庫，將得到的蛋白互作關系網導入Cytoscape軟件，得到PPI互作圖。使用R Studio對所有預測靶點進行GO與KEGG富集分析，獲得目的靶點參與關鍵通路的信息。

2.4 β-葡聚糖對S180細胞活性的影響

取對數生長期的S180細胞接種于96孔板中，每孔5000個細胞，培養2 h后，加入不同濃度的β-葡聚糖，每組設置5個復孔，同時設定空白對照組。藥物分別作用24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，孵育1.5 h，使用酶標儀于450 nm處測定光密度值（OD）。根據公式記錄β-葡聚糖對S180細胞的抑制率。抑制率（%）＝[（OD對照孔－OD實驗孔）/（OD對照孔－OD空白孔）]×100%。

2.5 動物模型的建立

取對數生長期S180細胞，調整細胞密度為7×105個·mL－1，于每只小鼠皮下接種0.2 mL細胞懸液，并對小鼠荷瘤情況進行觀察及記錄，接種部位出現實體瘤并伴隨腹部腫大則提示造模成功。

2.6 分組及給藥

取80只造模成功的荷瘤小鼠，適應環境飼養1周后隨機分為正常組，模型組，順鉑組，β-葡聚糖低（50 mg·kg－1）、中（100 mg·kg－1）、高（200 mg·kg－1）劑量組。正常組與模型組灌胃等體積的蒸餾水，順鉑組按照0.2 mg·kg－1的劑量腹腔注射順鉑，β-葡聚糖組按照對應劑量灌胃給藥。隔日給藥，1次·d－1。連續給藥3周，每周根據動物體質量情況調整給藥體積。

2.7 觀察指標

2.7.1 測定各組小鼠的抑瘤率及脾臟指數 給藥21 d后，眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠。檢測各組小鼠的抑瘤率及脾臟指數。抑瘤率（%）＝[（模型組腫瘤質量－實驗組腫瘤質量）/模型組腫瘤質量]×100%，脾臟指數＝脾臟質量/體質量。

2.7.2 小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量 采小鼠眼球靜脈血，放置6 h，使血清充分析出，1500 r·min－1離心10 min，收集血清。參照ELISA試劑盒說明書方法測定小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量。

2.7.3 蛋白印跡法（Western blot）測定小鼠瘤組織中Bax、Bcl-2、VEGFA、JAK2、STAT3蛋白的表達 將瘤組織加入液氮，研磨粉碎。通過增量法稱定質量，按照每1 mg添加10 μL的比例添加裂解液（RIPA∶PMSF＝100∶1），置于冰上裂解30 min。裂解后于4℃、12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取高溫變性后的蛋白質（20 μg/lane），采用8%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用1×TBST清洗3次，每次10 min，一抗4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗避光孵育2 h；曝光、顯影、定影。用凝膠圖像分析軟件分析各條帶光密度值，以β-actin為內參照，目的蛋白相對表達量以目的蛋白與β-actin光密度比值表示。

2.8 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 β-葡聚糖作用靶點及腹水瘤靶點預測結果、藥物-疾病-靶點相互作用網絡圖的構建

分別從數據庫中獲取β-葡聚糖的作用靶點33個與腹水瘤疾病靶點3116個。將上述靶點導入Veen數據庫進行交互分析（見圖1A），獲得交集靶點12個用于本實驗的后續研究。將藥物作用靶點與Veen圖中交集靶點導入Cytoscape 3.8.0，獲得藥物-疾病-靶點相互作用網絡圖，涉及DRD1、VEGFA、FGF2、HPSE、CDK1等12個交集靶點，見圖1B。

圖1 藥物-靶點Veen圖（A）與藥物-疾病-靶點網絡圖（B）Fig 1 Drug-target veen diagram（A） and drug-disease-target network diagram（B）

3.2 蛋白互作、GO及KEGG分析

將交互基因導入String數據庫，分析獲得VEGFA、STAT3、FGF2、HSP90AA1等8個靶點的相互作用關系，見圖2A。使用R Studio對交集靶點進行GO及KEGG富集分析，GO分析得到MAPK激酶的正向調控、內皮細胞趨化性的調節、蛋白激酶活性的激活、血管生成的正向調節、中腎小管形態的發生等生物過程與化學誘導活性、生長因子受體結合、成纖維細胞生長因子受體結合以及熱休克蛋白結合等分子功能，見圖2B、2C。通路富集分析得到癌癥中的蛋白多糖、EGFR酪氨酸激酶抑制劑、鈣信號通路、PI3K-Akt通路、MAPK信號通路、TH17細胞分化通路及HIF-1信號通路等15條通路，見圖2D。

圖2 蛋白互作網與GO、KEGG分析Fig 2 Protein interaction network and GO，KEGG analysis A.蛋白互作網絡圖（protein interaction network）；B.生物過程圖（bioprocess）；C.細胞組成圖（cell composition）；D.分子功能圖（molecular function）

3.3 生物學驗證

3.3.1β-葡聚糖對S180細胞活性的影響 如圖3所示，與對照組相比，各劑量β-葡聚糖作用24 h對S180細胞均無直接抑制作用。

圖3 不同濃度β-葡聚糖對S180細胞活性的影響Fig 3 Effect of different concentrations of β-glucan on S180 cell

3.3.2β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

如表1所示，與模型組比較，各給藥組均有顯著的抑瘤作用。其中順鉑組抑瘤作用最強，抑瘤率達到64.76%；β-葡聚糖給藥組抑瘤率伴隨著給藥劑量的增加呈上升趨勢。

3.3.3β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠脾臟指數的影響如表1所示，與空白組比較，模型組脾臟指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各劑量β-葡聚糖給藥組脾臟指數均顯著降低（P＜0.01）。

表1 β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及脾臟指數的影響( ±s，n＝8)Tab 1 Effect of β-glucan on tumor growth and spleen index of S180 tumor-bearing mice ( ±s，n＝8)

表1 β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及脾臟指數的影響( ±s，n＝8)Tab 1 Effect of β-glucan on tumor growth and spleen index of S180 tumor-bearing mice ( ±s，n＝8)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

組別 瘤質量/g 抑瘤率/% 脾臟指數/（mg·g－1）空白組 － － 3.81±0.57模型組 5.54±0.82 － 9.09±1.37**順鉑組 1.95±0.42## 64.76 5.25±1.01##低劑量組 4.64±0.45# 16.28 5.91±1.32##中劑量組 4.14±0.48## 25.32 6.57±1.03##高劑量組 3.04±0.47## 45.14 6.66±1.18##

3.3.4β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠相關細胞因子的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-2、IL-4水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，順鉑組及β-葡聚糖各給藥組IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平具有上升趨勢，IL-6水平具有下降趨勢。

表2 β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠細胞因子的影響( ±s，n＝8)Tab 2 Effect of β-glucan on cytokines in S180 tumor-bearing mice ( ±s，n＝8)

表2 β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠細胞因子的影響( ±s，n＝8)Tab 2 Effect of β-glucan on cytokines in S180 tumor-bearing mice ( ±s，n＝8)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，# #P＜0.01.

組別 TNF-α/（pg·mL－1） IFN-γ/（pg·mL－1） IL-2/（pg·mL－1） IL-4/（pg·mL－1） IL-6/（pg·mL－1）空白組 183.83±7.98 17.43±4.77 9.46±1.09 7.75±0.68 7.65±0.77模型組 196.61±17.61 22.36±2.70 5.61±2.20** 4.26±0.35** 12.74±0.77**順鉑組 283.39±16.45## 36.95±3.63## 7.00±0.44 5.24±1.40 9.16±1.68低劑量組 224.26±21.59## 20.08±3.07 6.87±1.39 7.22±0.69## 9.3±0.64#中劑量組 234.84±7.91## 25.38±3.81 7.23±1.96 5.76±0.72## 9.97±1.39##高劑量組 257.78±26.78## 31.67±4.09## 6.78±1.71 5.08±0.78 11.61±1.33##

3.3.5β-葡聚糖對Bax、Bcl-2、VEGFA、JAK2、STAT3蛋白表達的影響 如圖4所示，與模型組比較，順鉑組與β-葡聚糖各給藥組均能使Bax蛋白的表達上調，使Bcl-2、VEGFA、JAK2以及STAT3蛋白的表達下調。

圖4 Bax（A）、Bcl-2（B）、VEGFA（C）、JAK2（D）、STAT3（E）蛋白的相對表達量（P＜0.05，P＜0.01）Fig 4 Relative expression of Bax（A），Bcl-2（B），VEGFA（C），JAK2（D），and STAT3（E）protein（P＜0.05，P＜0.01）

4 討論

作為真菌細胞壁含量最高的多糖[10]，β-葡聚糖可對腫瘤細胞進行有效攻擊而對正常細胞無殺傷作用[11]。天然多糖因其治療效果顯著且毒副作用較輕而受到關注[12]。有研究表明，β-葡聚糖作為一種高效的生物應答物能夠提高機體免疫力[13]。因此本實驗觀察β-葡聚糖在體內外對S180腹水瘤的療效，并進一步明確其作用機制。

本文通過對已有數據集分析β-葡聚糖可能作用于腹水瘤的靶點，獲得12個潛在靶點，對其進一步分析明確交集靶點涉及VEGFA、STAT3等8個靶點；從GO與KEGG富集結果來看，β-葡聚糖可能通過干預MAPK激酶的正向調控、內皮細胞趨化性的調節、蛋白激酶活性的激活、血管生成的正向調節，調控PI3K-Akt、EGFR、MAPK等信號通路發揮作用。

本研究發現高劑量β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用較好，抑瘤率為45.14%。本實驗選擇了能夠反映細胞及體液免疫的脾臟指數[14]進行考察，發現各劑量β-葡聚糖給藥組均可降低脾臟指數。提示其抗腫瘤機制可能與對機體免疫器官的保護作用相關。

在腫瘤發生發展過程中，T淋巴細胞會釋放出多種細胞因子。細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-6可以結合自身相對應的受體調節細胞的生長、分化并對免疫應答過程進行調控[15]。其中，TNF-α含量在一定的范圍內可對受損的組織起到修復作用，但當其濃度異常升高時，也會對組織造成一定的損傷[16]。體內實驗研究表明，β-葡聚糖能夠升高小鼠血清中TNF-α含量，可能與增加血清中腫瘤壞死因子含量從而發揮抗腫瘤作用有關。IFN-γ由活化的Th細胞與NK細胞產生，可以促進Th1細胞的生長發育，對于免疫調控也具有一定的影響[17]。β-葡聚糖能升高小鼠血清中IFN-γ水平，可能與其可促進機體產生相應的免疫因子相關。IL-2可促進T細胞的生長，在抑制腫瘤細胞生長的特異性免疫反應中扮演重要角色。IL-4作為具有生物學活性的細胞因子，可以通過少量的分泌對人體起到保護作用，在感染以及腫瘤的治療中發揮作用。但當其分泌量較大時，將會促進腫瘤的發生發展。IL-6最初被作為一種炎癥因子被人們所認識，之后越來越多的研究發現IL-6在癌癥患者的體內還可作為“促瘤因子”發揮促瘤效應[18]。

有研究發現腫瘤細胞凋亡過程中紊亂的發生與腫瘤的產生密切相關，多種基因共同調控腫瘤細胞的凋亡過程，例如促凋亡基因、抑制凋亡基因及凋亡效應基因等[19]。Bcl-2家族在凋亡的過程中扮演著重要的角色，以具有對抗凋亡的Bcl-2蛋白以及促進凋亡的Bax蛋白為代表。當Bcl-2表達過高時，可以抑制細胞凋亡；但Bcl-2表達不足，Bax表達過量時，體內的Bax同源二聚體占據優勢，會促進細胞凋亡[20]。在本實驗中，相較于模型組，各給藥組的Bcl-2蛋白表達量均降低，Bax蛋白表達量均升高，以順鉑組最為明顯，高、中劑量的β-葡聚糖次之。

JAK-STAT信號通路經上游細胞因子產生刺激，而對下游包括Bcl-2、Bax及VEGF等靶基因進行調控并參與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等生物學過程[21]。VEGF作為生理和病理性血管生成所必需的促血管生成因子在腫瘤的發生發展中扮演著重要的角色[22]。STAT3作為信號轉導子和轉錄激活蛋白家族成員之一，其異常激活可上調VEGF的表達[23]。網絡藥理學預測結果表明，VEGF、STAT3靶點在β-葡聚糖治療腹水瘤中發揮重要作用。Western blot結果提示，相較于模型組，小劑量β-葡聚糖給藥組對其抑制作用不顯著，而β-葡聚糖中、高劑量組均能降低JAK2、STAT3以及VEGFA蛋白的表達量，并能顯著抑制腫瘤的生長。

聯合作用靶點分析發現VEGFA、JAK、STAT3與多條通路密切相關，表皮生產因子通路中的VEGF/JAK/STAT3靶點與凋亡抑制基因Bcl2及促癌基因Bax的蛋白表達情況如圖5所示。

圖5 PI3K-Akt及EGFR富集通路圖Fig 5 PI3K-Akt and EGFR enrichment pathway

一方面，β-葡聚糖通過影響JAK與Bcl-2蛋白相對表達量調控PI3K-Akt通路，改善腹水瘤小鼠炎癥狀態；另一方面，β-葡聚糖通過下調VEGFA、JAK2、STAT3蛋白表達水平及IL-6表達水平，上調IFN-γ、IL-2、IL-4水平，影響EGFR信號通路，從而抑制小鼠腹水瘤組織的表皮生長因子通路，發揮抗腫瘤作用，且β-葡聚糖還通過降低Bcl2和升高Bax的蛋白表達水平，抑制腹水瘤組織中腫瘤細胞的生長。

綜上所述，β-葡聚糖可能是通過影響JAK2/STAT3/VEGF等靶點，參與調節PI3K-Akt、EGFR等通路，從而發揮促進腫瘤凋亡的作用。