超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法定性分析枸櫞酸莫沙必利中的雜質(zhì)

王軍，邱榮英，郭玉，李鐵健，張貴蘭，張貴民*（1. 山東新時代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 27300；2. 國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 27300；3. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276005；. 山東省臨沂市蘭山區(qū)柳青街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，山東 臨沂 276005）

枸櫞酸莫沙必利，化學(xué)名為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺枸櫞酸鹽二水合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。該藥是大日本制藥有限公司開發(fā)的消化道促動力藥，于1998年6月首次在日本上市。該藥為第一個5-HT4受體激動劑，通過興奮胃腸道膽堿能中間神經(jīng)元及肌間神經(jīng)叢的5-羥色胺受體，促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，從而增強胃腸道運動，改善功能性消化不良患者的胃腸道癥狀，且不影響胃酸的分泌。另外其還可與其他藥物聯(lián)用，治療反流性食管炎及由此引起的咳嗽。由于枸櫞酸莫沙必利良好的療效，其在臨床應(yīng)用越來越廣泛。

圖1 枸櫞酸莫沙必利結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of mosapride citrate

目前對枸櫞酸莫沙必利的研究主要集中在合成、臨床療效、制劑與代謝方面，對其手性分離也有報道。但關(guān)于其雜質(zhì)研究方面的報道較少。近幾年LC-MS聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用越來越廣泛，可對藥物中存在的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)。本文采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS）定性分析了枸櫞酸莫沙必利中的6個雜質(zhì)，可為其工藝優(yōu)化與質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀、G6540B四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）以及MassHunter B.06.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

枸櫞酸莫沙必利（純度：99.0%，企業(yè)A）；雜質(zhì)2對照品（2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸，批號：520190901F，純度：99.9%）、雜質(zhì)3對照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-芐基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號：MSBL-G-180301Z，純度：99.5%）、雜質(zhì)4對照品（4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號：MSBL-E-180201Z，純度：99.9%）、雜質(zhì)5對照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號：MSBLF-180301Z，純度：99.2%）（山東新時代藥業(yè)有限公司）；乙酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；水為自制超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱YMC-Triart C柱（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；流動相：A為10 mmol·L乙酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序（0～5 min，15%B；5～10 min，15%～30%B；10～20 min，30%～90%B；20～21 min，90%～15%B；21～25 min，15%B）；柱溫40℃；波長274 nm，流速0.3 mL·min；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）源；正離子模式檢測；掃描范圍

m/z

50～800；毛細(xì)管電壓4 kV；裂解電壓55 V；錐孔電壓40 V；霧化氣溫度：350℃；干燥氣流速8 L·min。

2.3 供試品溶液的配制

稱取枸櫞酸莫沙必利樣品適量，用流動相定量稀釋至約1 mg·mL，取適量過0.2 μm濾膜，作為供試品溶液。

2.4 雜質(zhì)對照品溶液的配制

分別稱取雜質(zhì)2、3、4、5對照品適量，用流動相稀釋至約10 μg·mL，作為雜質(zhì)對照品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的優(yōu)化

日本藥典中檢測枸櫞酸莫沙必利原料藥的方法使用檸檬酸鹽水溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫分析，由于檸檬酸鹽難以揮發(fā)，故無法進(jìn)入質(zhì)譜分析，故需選擇揮發(fā)性流動相。筆者分別比較0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、10 mmol·L乙酸銨水溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)10 mol·L乙酸銨水溶液與乙腈梯度洗脫時各雜質(zhì)分離度較好；參考文獻(xiàn)報道，本研究最終采用了ESI源，在正離子模式下進(jìn)行樣品分析，且各雜質(zhì)具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)值，有利于雜質(zhì)的定性分析。

3.2 供試品溶液總離子流圖

供試品溶液進(jìn)入UPLC-Q-TOF-MS后，總離子流圖見圖2，按照出峰時間依次對雜質(zhì)進(jìn)行編號（1～6），主峰為莫沙必利。

圖2 枸櫞酸莫沙必利供試品溶液的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of mosapride citrate

3.3 莫沙必利質(zhì)譜信息

樣品主成分莫沙必利的二級質(zhì)譜圖見圖3，母離子峰

m/z

422.1652為[M＋H]峰，其二級質(zhì)譜碎片為

m/z

198.0319，且

m/z

198.0319與

m/z

200.0291豐度比約為3∶1，表明其含一個Cl原子。結(jié)合文獻(xiàn)報道，其裂解途徑如圖3所示，莫沙必利中連接A、B兩部分的酰胺鍵斷裂后，A部分形成了

m/z

198.0319碎片離子，該碎片可為雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)。

圖3 莫沙必利的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig 3 MS2 spectra of mosapride and fragmentation pathway

3.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

3.4.1 雜質(zhì)質(zhì)譜信息 6個雜質(zhì)經(jīng)過UPLC-QTOF-MS分析后，獲得各雜質(zhì)的精確分子量與二級質(zhì)譜碎片，具體質(zhì)譜信息見表1。結(jié)合雜質(zhì)的精確分子量，利用MassHunter軟件計算獲得分子式，再結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖4。

表1 枸櫞酸莫沙必利中雜質(zhì)的質(zhì)譜信息
Tab 1 MS information of impurities in mosapride citrate

No. 保留時間/min 母離子/（m/z） 分子式 誤差/（×10－6） 碰撞能量/eV 碎片離子/（m/z）1 10.21 440.1752[M＋H]＋ C21H27ClFN3O4 1.14 15 198.0317；271.0844 2 12.02 216.0424[M＋H]＋ C9H10ClNO3 0.93 8 169.9999；198.0314 3 12.73 404.1746[M＋H]＋ C21H26ClN3O3 2.48 20 198.0316 4 14.17 466.1142[M＋H]＋ C21H25BrFN3O3 1.29 20 241.9813 5 14.66 422.1646[M＋H]＋ C21H25ClFN3O3 1.18 20 198.0316 6 15.25 367.1232[M＋H]＋ C18H20ClFN2O3 3.55 15 198.0321

圖4 枸櫞酸莫沙必利中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig 4 Structure of impurities in mosapride citrate

3.4.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析 結(jié)合莫沙必利的裂解規(guī)律與雜質(zhì)二級碎片離子對各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析如下。

雜質(zhì)1：二級質(zhì)譜圖見圖5，母離子

m/z

440.1752 [M＋H]，經(jīng)軟件計算分子式為CHClFNO，比莫沙必利分子式多一分子HO。由于

m/z

198.0317碎片仍存在，參考莫沙必利裂解機制，該雜質(zhì)含有A部分結(jié)構(gòu)，因此判斷B部分結(jié)構(gòu)多了一分子HO。經(jīng)軟件計算碎片

m/z

271.0844離子組成為CHClNO，為母離子失去基團(tuán)CHFNO生成；而

m/z

271.0844繼續(xù)失去基團(tuán)CHNO則生成碎片

m/z

198.0317。由此推斷雜質(zhì)1的結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖5所示。

圖5 雜質(zhì)1的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 5 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 1

雜質(zhì)2：二級質(zhì)譜圖見圖6，母離子

m/z

216.0424 [M＋H]，經(jīng)軟件計算分子式為CHClNO，其中二級碎片含有

m/z

198.0314，說明含有A部分結(jié)構(gòu)。由于母離子

m/z

216.0424比

m/z

198.0314多18 Da，可判斷雜質(zhì)2脫水生成碎片

m/z

198.0314，由此判斷雜質(zhì)2含有OH基團(tuán)；碎片離子

m/z

169.9999為

m/z

198.0314脫去乙基形成的。由此推斷雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖6所示。通過與雜質(zhì)2對照品對比，保留時間、母離子與二級碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸。

圖6 雜質(zhì)2的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 6 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 2

雜質(zhì)3：二級質(zhì)譜圖見圖7，母離子

m/z

404.1746 [M＋H]，經(jīng)過軟件計算分子式為CHClNO，比莫沙必利少一個F原子。其中碎片離子

m/z

198.0316存在，說明含有A部分結(jié)構(gòu)，該部分為酰胺鍵斷裂生成，由此可推斷雜質(zhì)3的結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖7所示。結(jié)合文獻(xiàn)報道，并通過與雜質(zhì)3對照品對比，保留時間、母離子與二級碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-芐基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺。

圖7 雜質(zhì)3的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 7 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 3

雜質(zhì)4：二級質(zhì)譜圖見圖8，母離子

m/z

466.1142 [M＋H]與

m/z

468.1111 [M＋H]豐度比約為1∶1，初步判斷內(nèi)含一個Br原子，經(jīng)過軟件計算分子式為CHBrFNO，與莫沙必利分子式相比，可判斷Br原子取代了Cl原子；碎片離子

m/z

241.9813與

m/z

243.9810豐度比約為1∶1，可判斷碎片內(nèi)含一個Br原子，參考莫沙必利斷裂機制，初步判斷雜質(zhì)4失去B部分基團(tuán)生成該碎片。由此推斷雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)與可能的斷裂機制如圖8所示。通過與雜質(zhì)4對照品對比，保留時間、母離子與二級碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺。

圖8 雜質(zhì)4的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 8 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 4

雜質(zhì)5：二級質(zhì)譜圖見圖9，母離子

m/z

422.1646 [M＋H]，經(jīng)過軟件計算分子式為CHClFNO，與莫沙必利互為同分異構(gòu)體。由于存在碎片離子

m/z

198.0316，該基團(tuán)為酰胺鍵斷裂生成，說明含有A部分結(jié)構(gòu)。結(jié)合合成工藝，初步判斷為F原子位置異構(gòu)，通過與雜質(zhì)5對照品對比，保留時間、母離子與二級碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，判斷雜質(zhì)5的結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖9所示。

圖9 雜質(zhì)5的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 9 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 5

雜質(zhì)6：二級質(zhì)譜圖見圖10，母離子

m/z

367.1232 [M＋H]，經(jīng)過軟件計算分子式為CHClFNO。由于存在碎片離子

m/z

198.0321，說明含有A部分結(jié)構(gòu)。碎片

m/z

198.0321為母離子失去基團(tuán)CHFNO生成，參考“3.4.3”項下的合成路線，該基團(tuán)與化合物Ⅲ分子式一致，由此判斷雜質(zhì)6的結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖10所示。3.4.3 雜質(zhì)來源推測 根據(jù)文獻(xiàn)報道，枸櫞酸莫沙必利的合成路線如圖11所示。結(jié)合表1中的雜質(zhì)質(zhì)譜信息與圖11合成路線對各雜質(zhì)來源推導(dǎo)如下。

圖10 雜質(zhì)6的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 10 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 6

圖11 枸櫞酸莫沙必利合成路線Fig 11 Synthetic route of mosapride citrate

雜質(zhì)1為化合物Ⅴ生成化合物Ⅵ過程中，兩個OH未發(fā)生脫水縮合形成嗎啉環(huán)，繼續(xù)參與下一步反應(yīng)，最終形成了該雜質(zhì)；雜質(zhì)2為枸櫞酸莫沙必利酰胺鍵水解生成；雜質(zhì)3結(jié)構(gòu)上比莫沙必利少了一個F原子，初步判斷為化合物Ⅱ（對氟苯甲醛）中含有部分苯甲醛雜質(zhì)，苯甲醛參與合成反應(yīng)最終生成了該雜質(zhì)，該雜質(zhì)已見報道；雜質(zhì)4為化合物Ⅶ中含有部分溴代雜質(zhì)（2-乙氧基-4-氨基-5-溴苯甲酸），該溴代雜質(zhì)與化合物Ⅵ反應(yīng)生成；雜質(zhì)5為化合物Ⅱ中含有的間氟苯甲醛參與合成反應(yīng)生成；雜質(zhì)6為殘余的化合物Ⅲ與化合物Ⅶ發(fā)生副反應(yīng)生成。

4 小結(jié)

由于美國、歐盟的藥品注冊管理部門對雜質(zhì)鑒定有嚴(yán)格要求，對藥物中含量≥0.1%的雜質(zhì)要求進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，鑒定結(jié)構(gòu)后可為原料藥的質(zhì)量控制與合成工藝提供依據(jù)。由于TOF技術(shù)能準(zhǔn)確測定樣品的精確分子量，而且在全掃描和二級質(zhì)譜分析過程中具有非常高的靈敏度，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法對枸櫞酸莫沙必利中的6個雜質(zhì)進(jìn)行了定性研究，通過與雜質(zhì)對照品對比，鑒定了其中4個雜質(zhì)。需進(jìn)一步優(yōu)化工藝路線與存儲條件，避免雜質(zhì)的產(chǎn)生。本文可為枸櫞酸莫沙必利的工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制提供參考。