保腎片超高效液相色譜指紋圖譜的建立及化學模式識別分析

陸崟，李金慈，盛華，唐安福，蘇華，湯淏（東部戰區總醫院藥劑科，南京 210002）

保腎片是由蓼科植物大黃經醇提和水提等一系列工藝制成的中藥制劑，為東部戰區總醫院腎臟科的常用制劑，在臨床用藥中占據重要地位。該藥具有升清消濁、調節代謝的作用，通過緩解“殘余腎”的高代謝狀態、影響氮質代謝及腎系膜細胞增殖和功能而發揮保護腎功能的作用，臨床主要用于慢性腎功能不全氮質血癥期的治療。保腎片現有質量標準是采用薄層色譜法對制劑中的大黃素進行鑒別，并結合高效液相色譜法對大黃酸、大黃素和大黃酚的總量進行測定。然而，中藥是以多組分、多靶點發揮作用的，對其中某一個或某幾個指標成分的控制難以全面反映其整體質量。

中藥多為復雜的化學成分群，采收、加工、生產等各個環節均會對質量產生影響，而中藥質量直接影響其臨床療效和用藥安全。如何對復雜的中藥體系進行合理的質量控制，始終是中藥現代化發展過程中的熱點與難點問題。中醫治療疾病的理論精髓是整體觀念和辨證論治，在尚不能明確中藥全部藥效物質的今天，應遵循中藥的用藥特點、基于中藥整體物質群科學地建立其特色的、系統的質量評價方法。中藥指紋圖譜實現了以現有分析技術為載體全面挖掘中藥中的化學成分信息，目前在中藥真偽鑒別、質量一致性評價等方面應用廣泛，并已受到國內國際一致認可。然而完全通過人為方式辨識指紋圖譜的龐大數據信息是不可能且不客觀的，因此常常將化學模式識別技術與指紋圖譜相結合來進行多維數據的解析。因此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）首次建立了本院制劑保腎片的指紋圖譜，通過相似度評價對保腎片的質量穩定性進行整體評價，通過聚類分析（CA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）尋找不同批次樣品間的差異，為綜合評價制劑質量、提升質控標準提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ 型UPLC儀，配 備G7117B DAD檢測器、OpenLAB CDS ChemStation工作站（美國安捷倫科技公司）；AE240型電子天平（梅特勒-托利多）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；GM-0.33A型真空泵、0.45 μm針頭過濾器（天津津騰科技有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：110831-201204，含量：89.9%）、大黃素（批號：110756-201512，含量：98.7%）、大黃酚（批號：110796-201621，含量：99.2%）、大黃素甲醚（批號：110758-201013，含量：99.8%）、蘆薈大黃素（批號：110795-201308，含量：98.0%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），冰醋酸為分析純（上海申博化工有限公司），超純水為實驗室自制。16批保腎片（規格：0.3 g/片自制，編號S1～S16，批號分別為20200116、20200224、20200325、20200420、20200514、20200602、20200611、20200626、20200710、20200805、20200901、20200925、20201015、20201029、20201117、20201216），各批次制劑所用飲片來源見表1。

表1 原料飲片樣品信息
Tab 1 Information of raw herbal materials

編號 廠家 批號 基源 產地S1 華云藥業 190901 藥用大黃 青海S2 華云藥業 190901 藥用大黃 青海S3 華云藥業 191001 藥用大黃 青海S4 華云藥業 191001 藥用大黃 青海S5 華云藥業 191001 藥用大黃 青海S6 華云藥業 191201 藥用大黃 青海S7 華云藥業 191201 藥用大黃 青海S8 華云藥業 191201 藥用大黃 青海S9 華云藥業 191201 藥用大黃 青海S10 華云藥業 191201 藥用大黃 青海S11 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S12 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S13 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S14 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S15 南京鶴齡 191101 唐古特大黃 青海S16 南京鶴齡 191101 唐古特大黃 青海

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Por oshell 120 EC-C（2.7 μm，4.6 mm×50 mm）；流動相：甲醇（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6.0 min，6%～20%A；6.0～15.0 min，20%～40%A；15.0～28.0 min，40%～60%A；28.0～33.0 min，60%A；33.0～36.0 min，60%～100%A；36.0～39.0 min，100%A）；流速0.8 mL·min；柱溫30℃；進樣量1 μL；檢測波長260 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品20片，去薄膜衣，研細，精密稱取0.5 g置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，水浴加熱回流1 h，取出放冷，再次稱定質量，甲醇補足減失質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成含沒食子酸50.55 μg·mL、蘆薈大黃素51.30 μg·mL、大黃素51.75 μg·mL、大黃酚59.55 μg·mL、大黃素甲醚68.40 μg·mL的混合對照品溶液，4℃儲存備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取S1號樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，以峰面積較大、分離度較好的3號峰為參照，結果12個共有峰相對保留時間

RSD

為0.010%～0.11%、相對峰面積

RSD

為2.3%～2.8%，表明儀器精密度良好。2.3.2 穩定性試驗 取S1號樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖。以3號峰的保留時間和峰面積為參照，結果12個共有峰相對保留時間

RSD

為0.010%～0.20%、相對峰面積

RSD

為1.8%～2.4%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定性良好。2.3.3 重復性試驗 取S1號樣品6份，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，以3號峰為參照，結果12個共有峰相對保留時間

RSD

為0.011%～ 0.18%、相對峰面積

RSD

為0.87%～1.1%，表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

分別取S1～S16號保腎片，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣分析。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）”軟件進行色譜圖數據的分析處理，以S1號樣品圖譜為參照，時間窗寬度設為0.1 s，采用中位數法生成對照圖譜R，經多點校正后全譜峰匹配建立指紋圖譜，結果見圖1。共確定了12個共有峰，共有峰峰面積之和占色譜圖總峰面積的81.11%，符合要求。取“2.2.2”項下對照品溶液進樣分析，根據保留時間和紫外吸收光譜進行對比，指認出12個共有峰中的5個，分別為1號峰（沒食子酸）、9號峰（蘆薈大黃素）、10號峰（大黃素）、11號峰（大黃酚）、12號峰（大黃素甲醚），見圖2。

圖1 16批保腎片的UPLC指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprints of 16 batches of Baoshen tablets

圖2 混合對照品色譜圖（A）與對照圖譜R（B）Fig 2 UPLC chromatogram of mixed reference substances（A）and control fingerprint R（B）

根據“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）”計算得出S1～S16號保腎片樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.860～0.997，具體結果見表2，其中14批樣品的相似度均大于0.9，表明不同批次保腎片相似度較高，制劑工藝較穩定。S15、S16兩批保腎片的相似度相對較低，可能與原料藥材不同有關。

表2 16批保腎片相似度評價結果
Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Baoshen tablets

?

以3號峰為參照峰（S峰），計算16批樣品中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各批樣品的相對保留時間

RSD

為0.060%～0.65%，波動極小，但相對峰面積

RSD

為14%～110%，波動較大，表明不同批次保腎片中共有成分的含量存在差異。

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 CA 以共有峰峰面積與樣品取樣量的比值作為變量建立數據矩陣，導入SPSS 25.0統計軟件，以平方歐氏距離為度量標準，采用組間聯接法進行系統聚類，結果見圖3。由樹狀圖可知，類間距為5～10時樣品可分為兩類，第一類樣品為S1～S10，相似度均大于0.99，第二類樣品為S11～S16，相似度相差較大，說明16批保腎片整體質量基本穩定，但因原料飲片來源不同導致各批次制劑的共有成分存在差異。

圖3 16批保腎片的CA結果Fig 3 Cluster analysis of 16 batches of Baoshen tablets

2.5.2 OPLS-DA 由上述CA分析和相似度分析結果可知，不同批次保腎片樣品之間存在一定差異。為了進一步明確16批保腎片之間的差異，將“2.5.1”項下數據矩陣導入Simca-P14.1多元統計軟件，對樣品共有峰聚類所得的兩大類進行OPLS-DA分析。由圖4可知，樣品分組區分良好，當提取2個主成分時，模型主成分回歸系數為：

RX

＝0.893，

RY

＝0.998，

Q

＝0.994，均高于0.5，且差距小于0.2，說明所建模型有效，且有較高的穩定性和預測能力。由載荷圖（見圖5）可看出11號、4號和3號色譜峰距離中心的離散程度較高，說明這幾種成分對保腎片制劑的質量穩定性影響較大。變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）可直觀反映各變量對模型分類的整體貢獻度，當VIP＞1.0時表明該色譜峰為具有統計學意義的差異標志物。由圖6可知，VIP值大于1.0者為峰11（VIP＝2.1746）、峰4（VIP＝2.0980）、峰3（VIP＝1.1045），提示這3種成分對不同批次保腎片的質量一致性具有顯著影響，在生產過程的質量控制中可重點關注它們的變化情況。

圖4 16批保腎片OPLS-DA得分圖Fig 4 OPLS-DA score plot of 16 batches of Baoshen tablets

圖5 16批保腎片OPLS-DA載荷圖Fig 5 OPLS-DA loading plot of 16 batches of Baoshen tablets

圖6 16批保腎片OPLS-DA變量重要性投影圖Fig 6 OPLS-DA VIP plot of 16 batches of Baoshen tablets

2.6 指標成分含量測定

按文獻方法對16批樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量進行測定，結果見表3和圖7。由結果可看出，各批次樣品中大黃酸的含量差異較大，其余兩種成分的含量存在波動，結果與OPLS-DA相一致，這可能是原料飲片廠家更換所導致。

圖7 指標成分含量測定折線圖Fig 7 Content determination of index components

表3 保腎片中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量測定結果(mg/片)Tab 3 Content of rhein，emodin and chrysophanol in Baoshen tablets (mg/slice)

編號 大黃酸 大黃素 大黃酚 3種成分總量S1 0.07 0.99 4.06 5.12 S2 0.08 0.92 3.82 4.82 S3 0.09 1.07 4.18 5.35 S4 0.09 1.07 4.10 5.26 S5 0.07 1.24 5.66 6.98 S6 0.14 1.06 4.61 5.81 S7 0.05 0.59 2.48 3.12 S8 0.14 1.06 4.61 5.81 S9 0.19 0.82 3.18 4.18 S10 0.30 1.15 5.05 6.49 S11 0.37 1.30 5.23 6.90 S12 1.01 1.67 5.77 8.45 S13 1.20 1.99 5.69 8.88 S14 1.09 1.82 6.13 9.04 S15 2.21 1.56 4.80 8.58 S16 2.18 1.47 4.70 8.34

3 討論

本研究采用UPLC建立保腎片的指紋圖譜，與普通液相色譜法相比，具有分離度更高，檢測更靈敏，分離時間更短的優勢。在文獻研究基礎上，以色譜圖的出峰數和峰面積為指標，對保腎片的提取條件（提取溶劑、提取方法、回流時間）進行了考察，結果顯示以甲醇為溶劑水浴加熱回流1 h所獲得的供試品溶液色譜峰最多且響應值較高。通過調整流動相的組成和洗脫梯度，比較不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min）、不同柱溫（25、30、35℃）、不同波長（254、260、280 nm）條件下的分離分析效果，發現在本文色譜條件下所獲得的色譜圖基線更平穩、色譜峰信息更全面、峰形與分離度俱佳。

指紋圖譜提供的信息龐大而復雜，需要采用合理的數據挖掘工具對其進一步解析，化學模式識別技術則可有效解決這一問題，具有良好的預測性和廣泛的適用性。常用的化學模式識別方法分為聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）等無監督模式識別和OPLS-DA、線性判別分析等有監督模式識別兩種，它們不僅可單獨使用，還可結合在一起用于中藥質量控制。本文將CA與OPLS-DA相結合用于保腎片指紋圖譜數據挖掘。

本研究通過相似度分析發現16批保腎片指紋圖譜相似度在0.860～0.997，12個共有峰的相對保留時間高度吻合（

RSD

小于0.65%），說明該制劑的指紋圖譜穩定可靠。CA發現16批保腎片可以分為兩類，S1～S10聚為一類，S11～S16聚為一類，說明更換原料藥材廠家對制劑質量的均一穩定性產生了一定的影響。為了明確差異所在，進一步采用OPLS-DA進行篩選，得到了峰3、峰4、峰11顯著性差異成分3種，其中11號峰為大黃酸，3號峰和4號峰未能與對照品比對，后期需通過質譜等技術進一步研究。通過對保腎片指標性成分進行含量測定，發現各批次樣品中大黃酚的含量差異較大，這與OPLS-DA結果相一致。大黃是一種典型的多基原、多產地藥材，《中國藥典》2020年版中收載的正品大黃為蓼科植物掌葉大黃

Rheum palmatum

L.、唐古特大黃

Rheum tanguticum

Maxim

. ex

Balf

.

或藥用大黃

Rheum officinale

Baill

.

的干燥根和根莖。大黃對生長環境要求較為嚴苛，其生長過程中的溫度、濕度、光照、遺傳、土壤狀態、采收時間等因素均會影響藥材質量。已有研究表明藥用大黃和唐古特大黃親緣關系較近，指紋圖譜CA和PCA均不能將其區分開，但指標成分含量測定結果顯示唐古特大黃中游離型蒽醌與結合型蒽醌的總含量均高于其他大黃品種。本研究中發現保腎片制劑原料飲片更換后對制劑質量產生了一定的影響，大黃酸、大黃素、大黃酚總量均大于3.0 mg/片，整體上符合當前質量標準的要求，但大黃酸的含量差異較大，S15、S16的原料藥材來源于唐古特大黃，大黃酸含量顯著高于其他批次保腎片。由此可見現有的質量標準尚不能完全體現保腎片生產全過程的質量穩定性，若將含量測定與指紋圖譜相結合，可更全面、客觀地表征藥物信息及工藝穩定性。

綜上所述，本試驗建立了保腎片的UPLC指紋圖譜，分析方法穩定可靠、簡便易行、高效快速，進一步結合CA和OPLS-DA對指紋圖譜進行綜合評價，可較全面地反映制劑的整體信息和特征信息，為保腎片制劑質量控制的改善和標準的提高提供了科學依據。