柯里拉京對照品的制備及其結構鑒定

鄭有德，陳小紅，莫太剛，2，，樊三虎，2，，駱學慶，孟倫秀，張定堃（. 成都三勒漿藥業集團四川華美制藥有限公司，成都 60045；2. 乳品營養與功能四川省重點實驗室，成都 6002；. 成都三勒漿藥業集團-成都中醫藥大學產學研聯合實驗室，成都 60045）

柯里拉京（corilagin，分子式：CHO），又稱柯子次鞣素、訶里拉京，屬天然植物多酚單寧酸類化合物，為類白色固體粉末，可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等有機溶劑。柯里拉京是一種可以從許多植物提取的水溶性逆沒食子酸鞣質，如蜜柑草屬植物、牦牛兒苗屬植物、老鸛草屬植物、大戟屬植物、鐵莧屬植物、安石榴屬植物、槭屬植物及欖仁樹屬植物等。柯里拉京為葉下珠、老鸛草、蜜柑草、白三草等植物的有效成分，也存在于余甘子、龍眼、橄欖、訶子中等。研究表明柯里拉京具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗纖溶、降血壓、抑制病毒、抗菌、抗炎等。

本文以葉下珠全草為研究對象制備高純度柯里拉京對照品，現報道如下。

1 材料

大戟科油柑屬植物葉下珠（

Phyllanthus urinaria

L.）干燥全草購于成都五塊石藥材市場，產地四川廣元，經吳燕成總工程師確認。95%乙醇（批號：20021018）、鹽酸（批號：20020816）（分析純，成都光華化學試劑廠），乙腈（分析純，上海陸都實業有限公司，批號：20021028），丙酮（分析純，重慶東試化工有限公司，批號：20021116），D101大孔樹脂（天津南開大學精細化學試驗廠，批號20021206），Sephadex LH-20（瑞典，批號：292931），Diaion HP-20（日本三菱化學公司，批號：2H508），硅膠GF254（化學純，國家藥典委員會監制青島海洋化工集團公司，批號：9639）；紫外燈、Water 2996高壓液相色譜儀（Waters）。

2 方法與結果

2.1 提取分離與純化

① 稱取葉下珠干燥全草300 g，鍘成3～5 cm的段，加入20倍以上純水浸泡0.5 h，分別微沸煎煮1.5、1 h，濾過，合并兩次濾液，減壓濃縮至約1.2 kg，離心除去沉淀。② 濃縮液通過D101大孔吸附樹脂，用至少20 L純化水洗滌，檢測后棄去水液。用70%乙醇洗脫至無柯里拉京檢出，洗脫液減壓濃縮，置入蒸發皿中揮去殘留乙醇，得濃縮液200～400 mL。③ 濃縮液放冷，濾過，濾液通過Diaion HP-20 大孔吸附樹脂，用10 L以上純化水洗滌，檢測后棄去水溶液。用70%乙醇洗脫，至無柯里拉京洗出，洗脫液減壓濃縮，入蒸發皿中揮去殘留乙醇，濃縮液放冷加入7倍乙腈攪拌均勻，沉淀0.5 h，濾除沉淀，濾液減壓濃縮回收乙腈，再入蒸發皿中揮去殘留乙腈，得濃縮液約100 mL。④ 濃縮液放至室溫，小心置Sephadex LH-20柱上端，用約10 L蒸餾水洗滌，檢測后棄去洗滌液。用20%丙酮液洗脫，至無柯里拉京檢出，洗脫液減壓濃縮，入蒸發皿中揮去殘留丙酮至有較多晶體析出，冷至室溫，充分冷藏，抽濾出結晶。⑤ 柯里拉京粗結晶，用50%～60%乙腈反復重結晶至得到近白色結晶。結晶揮去溶劑后放入五氧化二磷干燥器干燥至恒重，得柯里拉京2.4 g，平均收率約0.8%。

2.2 純度分析

2.2.1 薄層色譜 取柯里拉京，加甲醇制成每mL含5 mg的溶液，照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部附錄）試驗，取此溶液4、8、12、16、20 μL，點于硅膠GF薄層板或十八烷基鍵合硅膠（PR-18 FS）薄層板上，分別以乙腈-10%醋酸（9∶1）或乙腈-HO（2∶8）為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光（365 nm）下觀察，或噴以1%FeCl-乙醇溶液，結果薄層板顯單一色斑，除主斑點外均未見雜質斑點。

2.2.2 純度測定色譜柱：Lunar C（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸（20∶80），檢測波長：220 nm、254 nm、272 nm、330 nm；柱溫：30℃，進樣量：10 μL。結果均未見明顯雜質峰。

2.2.3 含量測定 照高效液相色譜法（《中國藥典》2020年版四部）測定。Water 2996型高效液相色譜儀及Water 2996可變波長檢測器，Empower工作站，手動進樣器，C色譜柱（Lunar，Phenomenex，150 mm×4.6 mm，5 μm），溶劑均為色譜純，試劑均為分析純。色譜條件為流動相：乙腈-0.5%醋酸（1∶9），檢測波長：272 nm，流速：1 mL·min，柱溫：25℃。取柯里拉京約0.8 mg，各3份，精密稱定，加水溶解并稀釋至10 mL，搖勻，即得。測得柯里拉京峰面積分別為2756 356、2724 593、2745 250，

RSD

為0.59%，按歸一法計算含量100%。

2.3 結構鑒定

mp 210℃（分解）；：－245（C，1.5，EtOH）；IR（KBr）cm：3416（羥基），1715，1695（羰基），1616，1532（苯環）等；MS（FAB）[M-H]＝633；MS（ESI）[M-H]＝633.07；H-NMR（400 MHz，MeOD）

δ

：7.08（2H，s，Galloy，A，H-2，6），6.72（1H，s，HHDP，B，H-2），6.69（1H，s，HHDP，C，H-2），6.39（1H，d，

J

＝4.0 Hz，Glucose-H-1），4.96～5.02（2H，m），4.55～4.57（1H，m），4.49（1H，d，

J

＝4 Hz），4.17～4.21（1H，m），4.01～4.03（1H，m）；C-NMR（100 MHz，MeOD）

δ

：95.0（glc-C-1），71.5（glc-C-2），76.1（glc-C-3），65.0（glc-C-4），76.1（glc-C-5），62.4（glc-C-6），120.5（Gal-C-1），110.9（Gal-C-2，6），146.3（Gal-C-3，5），140.4（Gal-C-4），166.6（Gal-C-7），125.4（HHDP，B，C-1），125.5（HHDP，C，C-1'），108.3（HHDP，B，C-2），110.1（HHDP，C，C-2），143.5（HHDP，B，C-3），143.8（HHDP，C，C-3'），135.1（HHDP，B，C-4；C，C-4'），144.3（HHDP，B，C-5；C，C-5'），115.0（HHDP，B，C-6），115.3（HHDP，C，C-6'），168.5（HHDP，B，C-7），170.1（HHDP，B，C-7'）。柯里拉京為白色結晶狀固體，mp 210℃（分解），： －245（C，1.5，EtOH），其溶液遇三氯化鐵呈深蘭色，紫外吸收光譜

λ

（MeOH）219 nm、272 nm；IR（KBr）cm：提示有羥基（3417），羰基（1715，1695），苯環（3077，1616，1532）；MS（FAB）示M＝633（M-1），結合H-NMR、C-NMR及DEPT譜，推定其分子式為CHO，分子不飽和度為17。重水交換試驗提示具有11個羥基，其中9個在H-NMR譜中出現在

δ

8.16～9.34的低場位置，提示為酚羥基。根據C-NMR中的

δ

92.2及其余

δ

62.2～77.7等5個碳的化學位移，可判斷分子中具有吡喃葡萄糖的結構部分；根據在H-NMR及H-H-COSY譜

δ

7.03（2H，s）、6.56（1H，s）及6.49（1H，s）出現4個不相關的芳質子信號，可以判斷該化合物分子中有沒食子酰基（galloyl）及HHDP（六羥基苯甲酰基）基團的取代。由于H-NMR中除糖H-1及糖H-2的偶合常數

J

外，其余糖上連位質子2，3，4，5間的偶合常數均較小這一特點，表明糖為C構象為船式構象，提示HHDP取代于糖的C-2及C-4或C-3及C-6位。H-C 化學位移相關試驗結果可見：糖H-1質子（

δ

6.20）與

δ

164.8的酯羰基相關，后者又與沒食子酰基（沒食子酰，A）上的芳質子（

δ

7.03）相關，證明沒食子酰基取代于糖C-1位；同樣，糖H-3質子（

δ

4.59）與

δ

166.8的酯羰基相關，后者又與HHDP（B）上的芳質子（

δ

6.58）相關；糖H-6質子（

δ

4.24）與

δ

167.1的酯羰基相關，后者又與HHDP（C）上的芳質子（

δ

6.52）相關，證明HHDP基取代于糖的C-3及C-6位。

根據以上理化常數及光譜數據，可確定本化合物為鞣質類化合物柯里拉京（結構式見圖1）。

圖1 柯里拉京的結構式Fig 1 Structure of corilagin

3 小結

葉下珠是提取柯里拉京較好的原料，分離難度小，收率穩定。文獻報道陜西、四川、廣西產的葉下珠中柯里拉京含量最高。本研究在純化的同時也對訶子、余甘子藥材中柯里拉京的成分進行了初步研究，結果提示以訶子提取物噴干粉及訶子提取液制備柯里拉京時發現其對葡聚糖凝膠污染較大，且分離難度大故而收率較低。余甘子及余甘子汁也尚難以作為提取柯里拉京的原料。

葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）是鞣質分離常用的樹脂，其缺點是對某些鞣質吸附太強而不易洗脫，從而影響凝膠壽命。精制純化過程中分別選用乙醇、甲醇和乙酸、丙酮作為洗脫劑，發現20%丙酮作為洗脫劑時效果較好。此外，當重結晶溶劑乙腈濃度為80%時會使母液濃縮后析出結晶過快，經摸索發現50%～60%乙腈較適宜。

致謝：

四川省中藥所羅澤淵、周德慶、羅學成；四川華美制藥有限公司總工程師吳燕成。本研究中結構鑒定由中國食品藥品檢定研究院分部等單位協助完成。