藥蜀葵中總黃酮提取工藝優化及其生物活性研究

薛濤濤，唐志書，孫強，胡曉慧，阮凱華，宋忠興，段金廒，許洪波*（. 陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心，秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 72083；2. 南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，南京 20023）

藥蜀葵（

Althaea officinalis

），為錦葵科蜀葵屬的多年生草本植物，其根、莖、葉和花均可入藥，主要以根為主，收錄于歐洲藥典，主產于歐洲等地區，我國多為栽培品種，是藥食兩用植物，根入藥有解表散寒、利尿止咳、消炎解毒的功效，作為茶飲可清喉利咽，還可作為觀賞性植物栽培。現代藥理實驗揭示，藥蜀葵提取物具有鎮咳、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調節和降血糖等作用。國內外化學研究表明，藥蜀葵富含黃酮、多糖和酚酸類成分，截至目前，從藥蜀葵中共分離得到40余個化合物，其中17個黃酮類，7個酚酸類，3個香豆素類，1個甾體類，1個三萜類。藥蜀葵作為民間藥用植物，資源分布廣泛，但是目前對于其基礎研究比較薄弱，功效物質成分不明確，作用機制不清晰。迄今為止，尚未有對總黃酮提取工藝優化及相關生物活性的研究報道。本實驗首次采用響應面法對藥蜀葵莖葉總黃酮的提取工藝進行優化，首次采用D101大孔樹脂對所得總黃酮進行了富集純化；并進一步考察藥蜀葵總黃酮的抗氧化活性及體外抑制

α-

葡萄糖苷酶的活性，以期為藥蜀葵總黃酮的開發利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

藥蜀葵莖葉收集于永壽縣監軍鎮陜西輝勝現代農業園區，經陜西中醫藥大學許洪波副教授鑒定為錦葵科蜀葵屬植物藥蜀葵（

Althaea officinalis

）的莖葉。蘆丁對照品（純度≥97%，批號：H24N9Z75966）和維生素C（V，純度≥99%，批號：J19O10R100374）（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS（美國Sigma公司）；阿卡波糖（純度≥98%，批號：wkq20031707）、對硝基苯基-

α

-

D

-葡萄糖吡喃苷（純度≥98%，批號：wkq20071504）（四川省維克奇生物科技有限公司）；D-101型大孔吸附樹脂（天津允開樹脂科技有限公司）；其他試劑（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器

Multiskan GO全波長酶標儀（Thermo Scientific，USA）；UV-2600型紫外分光光度計（日本島津公司）；H-2型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；TP-A2000型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；EYELA N-1100旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）；KQ-300 DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 樣品前處理

藥蜀葵莖葉樣品置于通風陰涼處陰干后，將其剪碎后保存備用。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制 采用NaNO-Al（NO）-NaOH比色法測定總黃酮含量。用60%乙醇溶解蘆丁對照品后制得0.2 mg·mL的對照品溶液。精確吸取不同體積對照品溶液（0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL）于25 mL量瓶中，加5% NaNO溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加10% Al（NO）溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加4% NaOH溶液10.0 mL，60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測定吸光度（

A

）值。以蘆丁質量濃度（

C

）為橫坐標（

X

），

A

為縱坐標（

Y

），繪制標準曲線并計算回歸方程為：

Y

＝6.455

X

＋0.0452（

r

＝0.9990），表明蘆丁在0.016～0.056 mg·mL與吸光度線性關系良好。

2.2.2 樣品溶液中總黃酮含量的測定 將提取液抽濾后濾液合并濃縮至約50 mL，轉移至100 mL量瓶中，然后用60%乙醇定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液。精密吸取2 mL樣品溶液于10 mL量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取0.5 mL供試品溶液，先后加入5% NaNO溶 液，10% Al（NO）溶 液 和4%NaOH溶液，用60%乙醇定容至刻度線，15 min后于510 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算出測定稀釋后樣品溶液總黃酮濃度，計算提取率，提取率（%）＝[黃酮的質量濃度（mg·mL）×稀釋倍數×最初溶液體積（mL）/10]/原料質量（g）×100%。

2.3 單因素實驗

準確稱取10 g干燥的莖葉碎片，回流提取，分別考察提取次數（1、2、3、4次）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）和提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對總黃酮提取率的影響。將供試品溶液按照總黃酮含量測定方法操作，根據標準曲線計算提取率，結果見圖1。綜合考慮時間和經濟成本，選擇提取次數為2次，料液比為1∶25，提取溶劑為50%乙醇，單次提取時間為2 h，提取溫度為80℃。

圖1 提取次數（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、提取時間（D）和提取溫度（E）對藥蜀葵總黃酮提取率的影響Fig 1 Effect of extraction time（A），solid-to-liquid ratio（B），ethanol concentration（C），extraction time（D）and extraction temperature（E）on the yield of total flavonoids of Althaea officinalis

2.4 響應面實驗

2.4.1 響應面實驗設計 基于單因素實驗結果，以總黃酮提取率為響應值，考察料液比（A）、提取時間（B）和乙醇濃度（C）三個因素，利用Design Expert 8.0軟件根據Box-Benhnken實驗設計原理設計并對相關數據進行分析，最后通過模型驗證最佳提取工藝。實驗設計因素及水平如表1所示，結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表1 響應面分析因素及水平
Tab 1 Factor and level of response surface experiment

水平 因素A.料液比 B.提取時間/h C.乙醇濃度/%－1 1∶20 1.5 40 0 1∶25 2.0 50 1 1∶30 2.5 60

2.4.2 優化結果及分析 根據Box-Benhnken響應面實驗結果，利用Design Expert 8.0軟件對表2的數據進行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率

Y

的函數：

Y

＝2.244－0.05875

A

－0.0475

B

－0.00875

C

－0.0525

AB

＋0.04

AC

－0.0425

BC

－0.252

A

－0.2345

B

－0.182

C

。

表2 響應面實驗設計及結果
Tab 2 Response surface design and experimental results

編號 A.料液比 B.乙醇濃度/% C.提取時間/hR.提取率/%1 1∶30 50 2.5 1.80 2 1∶20 60 2.0 1.84 3 1∶25 40 2.5 1.91 4 1∶30 40 2.0 1.78 5 1∶25 50 2.0 2.30 6 1∶20 40 2.0 1.87 7 1∶20 50 2.5 1.76 8 1∶25 40 1.5 1.80 9 1∶30 60 2.0 1.54 10 1∶20 50 1.5 1.90 11 1∶25 50 2.0 2.12 12 1∶25 60 2.5 1.77 13 1∶25 50 2.0 2.20 14 1∶25 60 1.5 1.83 15 1∶25 50 2.0 2.20 16 1∶25 50 2.0 2.40 17 1∶30 50 1.5 1.78

從表3可知模型的

F

＝9.290、

P

＜0.01，差異極顯著；失擬項

P

值為0.6815＞0.05，無顯著性差異，表明所選因素合理，不存在失擬因素；決定系數

R

＝0.9227和校正決定系數

R

＝0.8233表明實驗模型擬合程度良好；變異系數為5.02%，說明模型的重現性較好，回歸方程能夠解釋響應值的變異，實驗方法可靠，可用于藥蜀葵總黃酮提取工藝的條件優化。模型中一次項

A

、

B

和

C

，二次項

C

，交互項

AB

、

AC

和

BC

對響應值的影響均不顯著；二次項

A

、

B

（

P

＜0.01）對響應值的影響極顯著，說明實驗因素對響應值的影響是非線性關系。

表3 方差分析結果
Tab 3 Analysis of variance

方差來源 平方和 自由度 均方和 F值 P值模型 0.780 9 0.087 9.290 0.0039 A 0.028 1 0.028 2.950 0.1296 B 0.018 1 0.018 1.930 0.2076 C 0.001 1 0.001 0.065 0.8055 AB 0.011 1 0.011 1.180 0.3138 AC 0.006 1 0.006 0.680 0.4357 BC 0.007 1 0.007 0.770 0.4089 A2 0.270 1 0.270 28.560 0.0011 B2 0.230 1 0.230 24.730 0.0016 C2 0.140 1 0.140 14.890 0.0062殘差 0.066 7 0.009失擬項 0.019 3 0.006 0.540 0.6815純誤差 0.047 4 0.012總和 0.848 16 R2＝0.9227 R2 Adj＝0.8233

響應曲面圖能夠直觀反映各因素對提取率的影響程度，坡度越陡峭，說明操作條件對響應值的影響越顯著。如圖2所示，料液比對藥蜀葵總黃酮提取率影響最為顯著，其次是乙醇濃度和提取時間。

圖2 各提取因素之間的交互影響Fig 2 Different factors on the yield of flavonoids

2.4.3 最佳工藝條件及驗證 通過對數據進行分析，得到藥蜀葵的最佳提取工藝：提取次數2次，提取溫度80℃，乙醇濃度49.135%、料液比1∶24.451、提取時間1.987 h，藥蜀葵總黃酮提取率理論值為2.25%。由于實際操作的局限性，調整乙醇濃度為49.0%、料液比為1∶25、提取時間為2.0 h，其他條件不變，進行3次驗證實驗，得到藥蜀葵總黃酮的平均提取率為2.15%，

RSD

為0.50%，驗證結果與模型預測接近，表明所建立模型可靠，最優工藝可行性高。

2.5 總黃酮的富集和純化

將最優工藝下的提取液減壓濃縮至無醇味，吸附于預處理的大孔樹脂色譜柱（D101，12 cm×85 cm），依次用水、70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液濃縮為干浸膏，采用“2.2.2”項下方法進行黃酮含量測定。結果顯示經過D101大孔樹脂富集純化后得到的藥蜀葵總黃酮純度達到53.62%。

2.6 體外抗氧化活性測試

2.6.1 DPPH活性測試 參考文獻：精密量取100 μL不同濃度的樣品溶液于96孔板中，加入0.1 mmol·LDPPH溶液100 μL，避光反應30 min（室溫），于517 nm處測定吸光度值（

A

），設置樣品對照組

A

（等量無水乙醇代替DPPH溶液），對照組

A

（等量無水乙醇代替樣品溶液），空白對照

A

組（無水乙醇）和陽性對照組（V）。平行操作3次，計算清除率，清除率（%）＝[1－（

A

－

A

）/（

A

－

A

）]×100%。2.6.2 ABTS活性測試 將7.4 mmoL·LABTS溶液和2.6 mmoL·L過硫酸鉀溶液按1∶1混合，于室溫避光放置過夜后得到ABTS母液，稀釋母液至（0.7±0.02）（

A

），即得ABTS工作液。精確量取不同濃度的樣品溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL ABTS工作液，搖勻，靜置6 min，于734 nm處測定吸光度值。設置樣品對照組、對照組、空白對照組和陽性對照組（同DPPH法），平行操作3次，清除率計算同DPPH法。結果如圖3A、3C所示，藥蜀葵總黃酮在測定的濃度范圍內對DPPH、ABTS自由基的清除具有濃度依賴性。其

IC

值分別為（8.36±0.06）μg·mL、（8.45±0.14）μg·mL。陽性對照V的測試結果如圖3B、3D所示，V在2.0～15.6 μg·mL內對DPPH自由基的清除能力與濃度呈線性關系，其

IC

值為（6.40±0.31）μg·mL；在0.5～3.9 μg·mL內對ABTS自由基的清除能力與濃度呈線性關系，其

IC

值為（2.77±0.09）μg·mL。

圖3 藥蜀葵總黃酮和陽性對照VC對DPPH（A，B）和ABTS（C，D）自由基清除能力Fig 3 Scavenging effect of flavonoids and VC to DPPH（A，B）and ABTS（C，D）free radical

2.7 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性測試

本研究采用酶標儀微量法作為藥蜀葵富集純化后總黃酮體外抑制

α

-葡萄糖苷酶活性的檢測手段。實驗所用的緩沖溶液、底物溶液和酶液的配制方法參照文獻，具體步驟簡述如下：精密稱取藥蜀葵富集純化后總黃酮適量，用PBS緩沖溶液配制成不同濃度的樣品溶液。將50 μL樣品溶液，100 μL 0.1 U·mL

α-

葡萄糖苷酶溶液（用pH 6.9，0.1 moL·LPBS配制）依次加入到96孔板中，25℃下孵育5 min，立即加入5 mmoL·L底物（對硝基苯基-

α

-

D

-吡喃葡萄糖溶液）50 μL啟動反應，25℃下孵育5 min，孵育前后，記錄405 nm處吸光度值。本實驗設置樣品組

A

（加樣品、底物和酶液），酶組

A

（用PBS代替樣品），陽性對照組（阿卡波糖），平行操作3次，計算抑制率，抑制率（%）＝[（△

A

－△

A

）/△

A

]×100%。藥蜀葵作為傳統的藥食兩用植物，其具有明確的降血糖功效。基于此，作者對藥蜀葵總黃酮進行了

α-

葡萄糖苷酶抑制活性測試。結果如圖4，藥蜀葵總黃酮在測試濃度范圍（7.8～250.0 μg·mL）對

α

-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用且呈現濃度依賴性，其

IC

值為（76.63±1.12）μg·mL，抑制作用強于陽性對照阿卡波糖[

IC

值為（323.43±7.06） μg·mL]。

圖4 藥蜀葵總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶量效關系Fig 4 Dose-effect relationship for total flavonoids of Althaea officinalis inhibiting α-glucosidase

3 討論和結論

本研究首次利用響應面法設計優化得到藥蜀葵總黃酮的最佳提取工藝條件：提取次數2次，提取溫度80℃，料液比為1∶25，提取時間2.0 h，乙醇濃度49.0%，在該條件下預測提取率為2.25%，實際提取率為2.15%，預測值與測定值相符，表明優化的工藝可靠。由于經過最優提取工藝得到的是含有藥蜀葵總黃酮的粗提物，且提取率較低，因此需要對粗提物進一步的富集純化，以便后續的活性研究。D101大孔樹脂是分離純化總黃酮應用較為廣泛的非極性大孔樹脂；基于后續藥蜀葵總黃酮工業化大生產的考慮，本研究選擇D101大孔樹脂進行富集純化，其總黃酮純度達到53.62%。

許多疾病的發生與氧化有著密切的關系，其中自由基引發的氧化會導致機體衰老。攝入抗氧化物質能夠降低自由基對機體的氧化損傷。DPPH自由基和ABTS自由基是表征物質抗氧化活性實驗中應用最為經典的模型。本研究結果表明，藥蜀葵總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基均具有顯著的清除作用，特別是清除DPPH自由基的能力與陽性對照V相當。經過本研究富集純化所得的總黃酮抗氧化能力顯著，可為開發天然高效的抗氧化物質提供思路。

糖尿病是嚴重威脅人類健康的三大疾病之一。持續性高血糖會引發一系列并發癥，如心血管疾病等。有效控制餐后血糖上升是防治疾病發生的必要措施。

α

-葡萄糖苷酶作為降低餐后血糖的有效分子靶標，在碳水化合物轉變為葡萄糖的過程中至關重要。目前臨床常用藥物如阿卡波糖等，雖然降血糖作用顯著，但長期服用會引起多種不良反應，甚至產生耐藥性。因此，亟待尋找和開發新的

α-

葡萄糖苷酶抑制劑。相較于阿卡波糖，本研究首次發現富集純化得到的藥蜀葵總黃酮抗

α-

葡萄糖苷酶活性顯著，其

IC

值為（76.63±1.12） μg·mL。本研究結果可為藥蜀葵中總黃酮的開發利用提供參考。