發汗續斷中真菌群落的組成分析及其對川續斷皂苷Ⅵ積累的影響

周太敏，何華，徐嬌，江維克，潘琪，張成剛，周濤（貴州中醫藥大學，貴陽 550025）

中藥材續斷來源于川續斷科植物川續斷

Dipsacus asper

Wall. ex Henry的干燥根，具有補肝腎、強筋骨、續折傷等功效。川續斷皂苷Ⅵ是續斷藥材質量評價的指標成分，現代藥理研究表明其能預防骨質疏松、鎮痛。2020年版《中國藥典》規定續斷藥材需進行發汗加工。已有研究結果表明，續斷經發汗加工后，川續斷皂苷Ⅵ的含量會顯著升高，但是其對應的機制尚不清楚。研究表明，真菌在促進萜類、生物堿類等中藥活性成分的轉化及積累中發揮作用，可以用于提高中藥活性成分的含量，其對應的機制主要包括提供底物轉化的關鍵酶以及作為誘導子激發特定次級代謝產物的合成。趙慧在厚樸發汗的研究中發現，不同發汗階段的厚樸中內生真菌的數量存在差異，而內生真菌會對厚樸次級代謝產物的形成具有一定影響。

基于上述研究背景，推測續斷發汗后藥材中川續斷皂苷Ⅵ含量的變化與其真菌群落的構成有一定關系。因此，本研究在前期建立的續斷發汗條件的基礎上，對續斷發汗前后藥材中的真菌群落進行高通量測序，分析發汗前后續斷中的真菌群落差異，篩選出發汗續斷中的優勢菌，將優勢菌制備成誘導子與川續斷無菌苗共培養，探討優勢菌對發汗藥材中川續斷皂苷Ⅵ含量變化的影響，為解析中藥材發汗加工的科學內涵奠定理論基礎。

1 材料

1.1 試藥

新鮮川續斷、川續斷成熟種子采于貴州省龍里縣，經貴州中醫藥大學江維克教授鑒定為川續斷科植物川續斷

Dipsacus asper

Wall. ex Henry。將根洗凈，切段，取部分進行發汗處理，標記為DP3，未發汗樣品標記為CK。川續斷無菌苗來源于貴州中醫藥大學中藥民族藥資源研究院組培室；鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）菌株J35由本課題組從川續斷中分離鑒定。

對照品川續斷皂苷Ⅵ（批號：111685-201305，純度：99.29%，成都埃法生物科技有限公司）；乙腈（色譜純）、95%乙醇（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。微生物總DNA提取采用DNA試劑盒（Omega Biotek）；在上海美吉生物醫藥科技有限公司進行微生物測序。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（Alliance 2695，美國沃特斯公司）；電子天平（AG285，瑞士梅特勒公司）；振蕩培養箱（BSD-150，上海博訊醫療生物儀器）；PCR擴增儀（ABIGene Amp 9700型，美國）；5810R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 續斷發汗前后樣品的DNA提取和測序

將發汗前后的樣品分別用液氮研磨成細粉，平均分為3份，DNA試劑盒提取總DNA，檢測樣品DNA濃度和純度，PCR擴增真菌ITS1區，引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R （5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴增體系：引物ITS1F（5 μmol·L）和ITS2R（5 μmol·L）各0.8 μL，10×緩沖液和dNTPs（2.5 mmol·L）各2 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，DNA模 板 10 ng，超 純 水補足至20 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min，30個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸10 min。將真菌擴增子構建Miseq文庫并測序。

2.2 測序數據分析

原始序列使用Flash（1.2.11）軟件進行序列拼接，Fastp 軟件質控。根據聚類分析序列之間的相似性分為多個操作單元（Operational taxonomic unit，OTU），序列相似性域值97%，Usearch軟件（http：//www.drive5.com/usearch/）對物種OTU進行聚類和生物信息統計分析。RDP classifier 軟件（https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對每條序列進行物種分類注釋。真菌ITS數據庫為Unite（Release 8.0 http：//unite.ut.ee/index.php）。利用Mothur軟件（https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur）進行Alpha多樣性分析；基于分類學信息（域、界、門、綱、目、科、屬、種），運用R語言等相關軟件對發汗前后樣本的群落組成進行分析。根據發汗前后真菌物種差異分析得到的群落豐度數據，找出具有顯著差異的物種。

2.3 真菌誘導子的制備及共培養

鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）菌株J35接種于PDA液體培養基中，在搖床上以200 r·min的轉速培養5 d，分為兩份。一份用于川續斷皂苷Ⅵ含量分析，另一份用于制備真菌誘導子。121℃高溫高壓滅菌20 min，分離出菌絲體，接種至生長狀況健康且較一致的組培苗，共培養60 d，采用HPLC檢測川續斷皂苷Ⅵ含量。

2.4 川續斷皂苷Ⅵ含量的測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取適量川續斷皂苷Ⅵ對照品精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，稀釋至質量濃度為0.1016 mg·mL。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.3”項下PDA液體培養基發酵培養的真菌，分離菌絲及發酵液。量取發酵液40 mL減壓濃縮至黏稠，甲醇定容至40 mL，超聲40 min，過濾，濃縮，吸取2 mL色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，即得樣品。菌絲用甲醇定容至40 mL，后續制備同發酵液。菌株J35制備的誘導子與川續斷無菌苗共培養60 d后，去除無菌苗根表面瓊脂，清水洗凈，45℃烘干。磨成細粉，稱取10 mg于2 mL離心管中，吸取1.5 mL甲醇，超聲30 min，放冷。離心，吸取上清液于2 mL離心管中，揮干，精密吸取400 μL色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，即得樣品。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為Symmetry-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（30∶70），檢測波長為212 nm，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL·min，柱溫為30℃。

3 結果與分析

3.1 續斷發汗前后樣品測序數據統計

發汗前后樣品的原始數據經過質控及過濾后，獲得序列數及序列長度等信息，見表1。序列數平均52 448條；堿基數平均為13 343 250 bp；每條序列平均長度為255 bp。CK和DP3樣本的Coverage指數超過99%（見表2），表明樣本中大多數真菌群落均檢測到，數據質量可靠，可用于后續分析。

表1 續斷發汗前后樣品的測序數據
Tab 1 Sequencing data in crude and sweated

樣品信息 序列數/條 堿基數/bp 序列長度/bp CK_1 49 808 13 793 650 277 CK_2 47 057 12 442 372 264 CK_3 51 635 13 577 654 263 DP3_1 50 195 12 202 047 243 DP3_2 53 205 12 842 421 241 DP3_3 62 788 15 201 356 242

3.2 Alpha多樣性分析

對發汗前后樣品的Alpha多樣性指數的分析見表2。Shannon和Simpson指數均可反映樣品中微生物的多樣性。Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低；而Shannon值越大，說明群落多樣性越高。根據上述衡量標準，結合CK和DP3樣本的Shannon和Simpson指數，表明發汗后續斷中真菌群落的多樣性升高，但是兩者差異并無統計學意義。進一步對兩組樣本的Ace和Chao指數進行了分析，結果表明Ace和Chao指數在DP3樣品中均較高，表明發汗后續斷中真菌群落的豐富度顯著提高。

表2 續斷發汗前后樣品的Alpha多樣性評估指數統計
Tab 2 Alpha diversity evaluation indexes in both crude and sweated

注：與CK相比，＜0.05，＜0.01。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01.

評估指數 CK DP3 Shannon 2.731±0.265 3.236±0.011 Simpson 0.155±0.053 0.101±0.004 Ace 154.150±13.545 222.940±16.857**Chao 154.82±13.732 222.400±16.165**Coverage 0.999±4.250×10－5 0.999±6.40×10－5*

3.3 續斷發汗前后樣品的真菌群落組成及優勢菌分析

CK和DP3樣品在屬水平上的真菌組成見圖1。續斷發汗前后樣品中共鑒定到200個屬的真菌群落，其中有35個屬的真菌群落在發汗前后樣品中的相對豐度具有顯著差異（見表3），表明續斷發汗前后樣品中真菌組成的種類沒有改變，但是其相對豐度發生了明顯變化。由表3可知，續斷發汗后，蜜環菌屬 （

Armillaria

sp.）及螺旋聚孢霉屬（

Clonostachys

sp.）的真菌相對豐度分別下降了77%和81%，而鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）真菌的相對豐度是發汗前的16.8倍左右，成為了優勢菌屬。

表3 續斷發汗前后樣品真菌相對豐度差異性分析
Tab 3 Difference of fungi relative abundance in crude and sweated

注：與CK相比， ＜0.05，＜0.01，＜0.001。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01， ＜0.001.

菌屬 CK相對豐度 DP3相對豐度Armillaria sp. 33.140±8.522 7.487±0.910*Fusarium sp. 1.635±1.105 27.520±0.874***Clonostachys sp. 14.760±2.722 2.768±0.315*Minimelanolocus sp. 6.560±0.176 3.966±0.130*unclassified_f_Herpotrichiellaceae 1.935±0.317 5.786±0.388***Cyphellophora sp. 5.756±0.836 1.032±0.042*Cladosporium sp. 0.610±0.112 4.414±0.603**Alternaria sp. 0.240±0.054 3.055±0.781*Ilyonectria sp. 0.407±0.259 2.497±0.090**Neocosmospora sp. 0.149±0.045 2.283±0.112*Dactylonectria sp. 0.716±0.159 1.300±0.096**Plectosphaerella sp. 0.122±0.135 1.083±0.399*Macrophomina sp. 0.011±0.012 1.161±0.358*Cephalotrichum sp. 0.925±0.244 0.163±0.060*Titaea sp. 0.782±0.217 0.235±0.024*Filobasidium sp. 0.292±0.173 0.721±0.0417*Gibberella sp. 0.031±0.031 0.980±0.115**Trichoderma sp. 0.052±0.011 0.716±0.267*unclassified_o_Branch06 0.526±0.111 0.115±0.022*Thanatephorus sp. 0.126±0.027 0.270±0.062*Aureobasidium sp. 0.049±0.021 0.342±0.116*Alatospora sp. 0.317±0.073 0.031±0.013*Penicillium sp. 0.270±0.071 0.055±0.013*Hannaella sp. 0.032±0.032 0.277±0.093*unclassified_o_Saccharomycetales 0.003±0.005 0.260±0.099*unclassified_f_Nectriaceae 0.047±0.028 0.160±0.026**Dictyocheirospora sp. 0.061±0.021 0.136±0.024*Colletotrichum sp. 0.006±0.010 0.184±0.055*Cladophialophora sp. 0.159±0.058 0.009±0.009*Cylindrocarpon sp. 0.025±0.012 0.117±0.019**Haematonectria sp. 0.009±0.015 0.010±0.038*Metarhizium sp. 0.008±0.014 0.045±0.011*Setophoma sp. 0.001±0.002 0.051±0.010*Uncispora sp. 0 0.212±0.076*Memnoniella sp. 0 0.084±0.021*

圖1 CK和DP3樣本中真菌在屬水平上群落組成分析Fig 1 Community composition of fungi in CK and DP3 samples at the genus level

3.4 優勢菌屬的真菌J35對川續斷無菌苗中川續斷皂苷Ⅵ含量的影響

課題組利用前期從川續斷中分離的鐮刀菌屬內生真菌J35（

Fusarium

sp.）進行相關樣品中川續斷皂苷Ⅵ含量的檢測，結果顯示，J35發酵培養的發酵液及分離的菌絲體中雖未檢測到川續斷皂苷Ⅵ，但J35菌絲體制備的誘導子與川續斷無菌苗共培養60 d后，川續斷皂苷Ⅵ含量相比對照組（未加誘導子的川續斷無菌苗）顯著提高了約5.4倍（見圖2）。該結果表明，J35制備的誘導子能夠促進川續斷皂苷Ⅵ的積累，推測續斷發汗后川續斷皂苷Ⅵ含量升高與鐮刀菌屬真菌相關，可能與鐮刀菌屬真菌產生的中間代謝產物激發的信號通路有關。

圖2 不同處理樣品中川續斷皂苷Ⅵ的含量比較分析Fig 2 Comparative analysis of asperosaponinⅥ content in different treatment samples

4 討論

本研究通過真菌群落的高通量測序，發現續斷發汗后真菌群落的物種多樣性及豐富度均提高，鐮刀菌屬 （

Fusarium

sp.）、新赤殼屬（

Ilyonectria

sp.）以及赤霉菌屬（

Gibberella

sp.）等真菌群落的相對豐度顯著提高，表明發汗過程促進了上述真菌的增殖和代謝，這可能是發汗改變了續斷藥材的溫、濕條件從而影響微生物的代謝活動。

鐮刀菌屬真菌在續斷藥材發汗后相對豐度明顯增加，其對應菌屬的真菌J35菌絲體制備的誘導子能顯著提高川續斷無菌苗根中川續斷皂苷Ⅵ的含量，而其本身并不產生川續斷皂苷Ⅵ，表明J35可能是作為一個誘導因子通過調節或激活信號傳導途徑中與川續斷皂苷Ⅵ合成相關酶的表達，從而影響川續斷皂苷Ⅵ的合成和積累，這個過程可能還涉及茉莉酸、水楊酸、一氧化氮以及活性氧等信號分子。胡正平等通過茉莉酸甲酯（MeJA）處理川續斷的研究表明，MeJA可通過上調川續斷皂苷Ⅵ合成關鍵酶基因的表達來促進川續斷皂苷Ⅵ的積累，進一步表明茉莉酸在促進川續斷皂苷Ⅵ積累中的作用。課題組后續將繼續探討J35促進川續斷皂苷Ⅵ積累的機制，研究續斷發汗過程影響三萜皂苷類成分變化的機制，為揭示中藥材發汗加工的科學內涵奠定理論基礎。