黃芪-知母藥對對肺纖維化大鼠的抗炎作用及機制研究

鄭東梅，王星晨，張瑩，劉星星，劉雪英，王慶偉，3*（. 陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽7206；2. 空軍軍醫大學藥學系藥物化學教研室，西安 70032；3. 西安秦皇醫院，西安 70600；. 西安培華學院，西安7025）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是肺臟損傷后常見的病理過程，目前研究認為肺纖維化不可逆，嚴重者可引起呼吸衰竭。中醫將肺纖維化歸屬為“肺痿”范疇，肺痿以氣虛為根本病機，病證以痰、熱最為多見，病位在肺、胃，可累及脾腎，病理上肺脾腎三臟病變可互相影響；現代醫學認為，纖維化類疾病均表現為細胞外基質的沉積，其生物過程包含某些炎性細胞、纖維化因子、炎癥因子及相關蛋白參與的關鍵通路等。

黃芪，歸脾、肺經，可補肺脾之氣，生津止渴。知母，歸肺、胃、腎經，可滋腎陰，潤肺燥，瀉腎火。近代醫家張錫純所著的《醫學衷中參西錄》中記載黃芪、知母常作為藥對配伍的方劑有玉津湯、升陷湯、理郁升陷湯及速降糖煎Ⅱ號，現代藥學專著《施今墨對藥》 《中藥藥對大全》均收錄了黃芪-知母藥對。在黃芪-知母藥對有效成分含量的測定中，陳沛鑫等發現，與單味藥相比，兩者同比例配伍時更有利于成分溶出與轉化。研究發現，黃芪-知母同比例配伍常用于治療肺病，在新型冠狀病毒肺炎中也有應用，但其作用機制尚不明確。肺部疾病常伴隨著炎癥的產生，慢性炎癥可進一步發展為肺纖維化，嚴重者甚至發展為肺癌。基于此，本實驗擬采用博來霉素誘導大鼠肺纖維化，初步研究黃芪-知母藥對（1∶1）對肺纖維化的抗炎作用，并探討其機制，為中藥的臨床應用及二次開發提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠62只，體質量（200±20）g [空軍軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（軍）2015-006]。

1.2 試藥

黃芪、知母均購于西安天晟中藥飲片公司，經陜西中醫藥大學白吉慶教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.

var. mongholicus

（Bge.）Hsiao的干燥根；知母為百合科植物知母

Anemarrhena asphodeloides

Bge的干燥根莖。

稱取黃芪、知母藥材，每份約3 kg，6倍量80%乙醇加熱回流提取，每次2 h，合并醇提取液，旋蒸，濃縮，減壓回收乙醇，得黃芪浸膏1.335 kg，濃縮至每克提取物相當于原藥材1.972 g；得知母浸膏1.686 kg，濃縮至每克提取物相當于原藥材1.532 g，置4℃冰箱冷藏備用。

注射用鹽酸博來霉素（H 20055883，瀚暉制藥有限公司）；蘇木精伊紅（HE）染色液（G1005，武漢谷歌生物科技有限公司）；Masson染色套裝（G1006，Servicebio）；轉化生長因子-

β

（TGF-

β

）試劑盒、腫瘤壞死因子-

α

（TNF-

α

）試劑盒、白介素-10（IL-10）試劑盒（江蘇酶免有限公司）；核轉錄因子-

κ

B p65（NF-

κ

B p65）抗體（AF5006）、

α

-平滑肌肌動蛋白（

α

-SMA）抗體（AF1032）（Affinity公司）；TNF-

α

（ER 1919-22）、GAPDH抗 體（ET 1601-4）（華安生物有限公司）；HRP標記山羊抗兔抗體（GB 23303）、組化試劑盒DAB顯色劑（G1211）（Servicebio公司）。

1.3 儀器

xn300血細胞分析儀（希斯美康）；全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡、Nikon DS-U3型成像系統（日本尼康）；XSP-C204型顯微鏡（CIC）；TANON-5200型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

健康SD雄性大鼠62只，適應性喂養1周后，隨機選取52只，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg）進行麻醉，在大鼠頸部剪1 cm小口，鈍性鑷子逐層分離頸部肌肉，直至暴露氣管，用1 mL注射器緩慢注入博來霉素（5 mg·kg），注入后立即將大鼠直立并左右旋轉，使藥液在肺內均勻分布，建立大鼠纖維化模型。取剩余同批次大鼠10只，作為正常組。造模2周后，隨機選取經博來霉素處理過的大鼠2只處死，取肺組織行HE和Masson染色，觀察到有大量炎性改變和膠原生成，確定肺纖維化模型復制成功。造模成功后，取剩余的50只大鼠，運用隨機數表法將其分為模型組、醋酸潑尼松組、黃芪組、知母組、黃芪-知母藥對組，每組10只。正常組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水溶液灌胃；模型組造模后予以0.5%的CMC-Na水溶液灌胃；醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松3 mg·kg；黃芪、知母給藥劑量參照《中藥藥理與實驗方法》中人與大鼠表皮面積換算，分別為0.6846 g·kg和0.8812 g·kg；黃芪-知母藥對組給藥劑量以黃芪、知母生藥量計算。所有藥物均用0.5%的CMC-Na配制成溶液，每日給藥一次，每次5 mL·kg，連續給藥28 d。

2.2 取材

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg）麻醉，頸總動脈取血用于外周血細胞檢測。取肺組織，水洗，濾紙吸干，稱定質量，左側肺葉固定于4%多聚甲醛，右側肺葉于凍存管－80℃冰箱備用。

2.3 HE染色觀察肺臟病理學變化

各組大鼠左側部分肺組織制成石蠟切片，將脫蠟水化的切片進行蘇木精染色，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，伊紅染色，脫水，封片，觀察肺臟炎性細胞浸潤，肺泡腔內有無滲出物，有無充血水腫改變等，并采用Image J軟件對炎性細胞的藍色陽性染色進行相對定量分析，通過計算炎性細胞陽性面積和陽性區域進行定量。

2.4 Masson染色觀察肺臟膠原沉積程度

Masson染色按照試劑盒依次操作，左側肺組織切片脫水，封片，觀察肺泡結構及纖維結節，膠原沉積情況，并采用Image J軟件對膠原纖維的藍色陽性染色進行相對定量分析，通過計算膠原纖維陽性面積和陽性區域進行定量。

2.5 ELISA試劑盒測定大鼠血清中TNF-α、IL-10、TGF-β1水平

將凍存的血清樣本梯度放入－20℃和4℃解凍，試劑盒平衡到室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟加樣，溫育，洗板，檢測血清中TNF-

α

、IL-10、TGF-

β

含量變化。

2.6 免疫組織化學法檢測NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白陽性表達

石蠟切片脫蠟、水化后，枸櫞酸抗原修復緩沖液中進行抗原修復，置內源性過氧化物封閉液室溫避光孵育25 min，3%BSA室溫封閉30 min；加

α

-SMA（1∶1000）、TNF-

α

（1∶100）、NF

κ

B p65（1∶600）一抗，4℃孵育過夜；加二抗（1∶200），室溫孵育50 min；DAB顯色；蘇木素復染、脫水封片，陽性表達呈棕黃色或深棕。

2.7 Western blot法定量檢測NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白表達

將右側肺組織剪碎，在冰上勻漿，加入裂解液 裂 解30 min，10 000 g·min，4℃離 心10 min，取上清液進行蛋白定量，調整蛋白量后，取等量裂解產物，加入上樣緩沖液進行SDSPAGE電泳，電泳后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗，4℃孵育過夜，PBST洗滌，加二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌，化學發光法顯色，成像掃描分析系統保存圖像。以GAPDH蛋白表達水平作為內參，以各樣本與相應內參灰度值比值為蛋白相對含量。

2.8 統計分析

SPSS 25.0統計學軟件進行分析，數據以±

s

表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-

t

檢驗，

P

＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪-知母藥對對肺纖維化大鼠病理變化的影響

正常組大鼠肺泡結構清晰，無充血水腫結節現象；模型組大鼠肺泡間隔增寬，肺泡腔內充滿分泌物及滲出物且大量炎性浸潤（HE染色，見圖1a），肺實變區膠原增生明顯且聚集成塊狀（Masson染色，見圖1b），炎癥相對面積顯著增高（

P

＜0.01，見圖2a），肺臟纖維化相對面積顯著增高（

P

＜0.01，見圖2b）。與模型組比較，醋酸潑尼松組大鼠肺組織水腫、充血不明顯，肺臟損傷較為明顯和炎性改變減輕，肺泡腔見少量纖維組織及炎性浸潤，其炎癥及纖維化相對面積均顯著下降（

P

＜0.01）。黃芪-知母藥對組大鼠肺泡結構較完整，肺泡腔內少量滲出物，纖維增生不嚴重，可見少量炎性浸潤及纖維結節出現，其炎癥及纖維化相對面積均顯著下降（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。單味黃芪、知母治療后，肺泡結構基本完整，但肺泡腔內仍較多炎性浸潤，纖維結節較多，與模型組相比，其炎癥和纖維化相對面積均有下降，但差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

圖1 給藥28 d后各組大鼠HE染色（a）和Masson染色（b）情況（×100，n＝3）Fig 1 HE staining（a）and Masson staining（b）of rats 28 days after the administration（×100，n＝3）

圖2 各組肺纖維化大鼠肺臟炎性細胞（a）及纖維化面積（b）情況（n＝3）Fig 2 Relative area of pulmonary inflammatory cells（a）and fibrosis（b）of rat in each group（n＝3）

3.2 黃芪-知母藥對對肺纖維化大鼠外周血炎性細胞數目的影響

與正常組相比，模型組大鼠外周血白細胞數（WBC）、中性粒細胞數（PMN）、單核細胞數（MO）、淋巴細胞數（LYM）、嗜酸性細胞數（EO）均顯著升高（

P

＜0.01）。與模型組相比，醋酸潑尼松組WBC、PMN、MO、LYM、EO含量均顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；黃芪-知母藥對組WBC、PMN、MO、LYM顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；黃芪、知母組WBC、PMN、MO、EO、LYM含量均有降低，但差異無統計學意義（

P

＞0.05），見圖3。

3.3 黃芪-知母藥對對肺纖維化大鼠血清中炎癥因子含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-

α

、TGF-

β

含量均顯著升高（

P

＜0.01），IL-10水平顯著降低（

P

＜0.01）。與模型組相比，醋酸潑尼松和黃芪-知母藥對組大鼠血清TNF-

α

、TGF-

β

含量均顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01），IL-10含量顯著升高（

P

＜0.01）；知母組大鼠血清中TGF-

β

含量顯著降低（

P

＜0.05）；黃芪組、知母組大鼠血清中IL-10含量均顯著升高（

P

＜0.05），但TNF-

α

含量變化差異無統計學意義，見圖3。

3.4 黃芪-知母藥對對肺纖維化大鼠TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠肺泡區TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白陽性率及蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；與模型組相比，醋酸潑尼松組與黃芪-知母藥對組大鼠肺組織中TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白陽性率及蛋白表達顯著下降（

P

＜0.05，

P

＜0.01）（見圖4及圖5）。

圖5 黃芪-知母藥對對大鼠肺組織中TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表達的影響Fig 5 Effect of Astragalus membranaceus and Rhizoma Anemarrhenae couplet medicines on TNF-α，NF-κB p65，and α-SMA protein expression in pulmonary tissues of rats

4 討論

肺纖維化是一種慢性、進行性、致命性的纖維化間質性疾病，發病率呈上升趨勢。目前臨床多采用激素、免疫抑制劑及肺移植手術等進行治療，但有一定的不良反應及風險。近年來，中醫藥以多途徑、多靶點、副作用少、療效顯著等特點成為肺纖維化疾病的替代療法之一。肺纖維化疾病的發展可逐漸演變形成虛損性疾病，久之

患者肺臟損傷、消耗元氣、肺虛失養，以致肺氣閉郁、陰血虧耗，最終導致肺纖維化的發生。研究發現益氣養陰法較常規的激素及免疫抑制劑治療副作用更少，可改善患者肺功能、血氧飽和度，減緩肺纖維化進程。

研究發現，黃芪作為治療肺纖維化使用頻率較高的補益類藥物，可通過調控TNF-

α

的生成，抑制NF-

κ

B的活性來減輕肺組織炎癥損傷，保持肺組織結構的完整。知母作為清熱兼滋陰藥，通過降低肺臟系數，提高肺臟、血清中肺表面活性物質相關蛋白表達，減輕氣道及肺組織炎性細胞浸潤，減少肺損傷。黃芪-知母作為經典藥對之一，均歸肺經，其中黃芪性溫，味甘，可益氣、升陽而固澀；知母性寒，味苦，滋陰、苦降而滑利，兩者合用，一溫一寒、一升一降、一收一散，達相輔相成之效，以此為基礎的中藥方劑清金益氣湯已在臨床廣泛應用。已有研究表明，黃芪中總黃酮和皂苷類成分通過介導氧化應激和炎癥反應干預博來霉素誘導的大鼠肺纖維化，其中總皂苷通過調控TGF-

β

/smad信號抑制早期纖維化結節的產生。研究發現，知母主要化學成分為皂苷和雙苯吡酮類，知母皂苷BⅡ是皂苷類成分的代表，其可在mRNA和蛋白質水平上減少炎性細胞因子如IL-6及TNF-

α

的生成，且對核因子NF-

κ

B的活性具有一定抑制作用。有研究通過網絡藥理學發現雙苯吡酮類芒果苷通過結合關鍵蛋白靶點環氧合酶-2（COX-2），影響NF-

κ

B炎癥通路，從而發揮抗炎作用。另有學者發現炎癥反應失控是導致纖維化發生的根源，也是促進肺纖維化病程進展的重要機制。肺臟發生纖維化后，肺臟組織細胞和相應免疫細胞釋放大量炎性因子如TGF-

β

、IL-10、TNF-

α

，這些炎性因子相互作用，引發一系列級聯反應，加重肺損傷。本實驗通過測定肺纖維化大鼠外周血炎性細胞數和肺纖維化大鼠血清中TNF-

α

、TGF-

β

和IL-10的含量，發現黃芪-知母藥對可調控炎性因子TNF-

α

、TGF-

β

和IL-10的水平，從而改善炎性損傷。本實驗進一步觀察了NF-

κ

B炎癥通路中TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白的陽性變化，探討黃芪-知母藥對調控肺纖維化大鼠NF-

κ

B炎癥反應通路的作用機制。TNF-

α

是參與炎癥反應關鍵的促炎因子，其過表達會趨化中性粒細胞，增加局部淋巴細胞的浸潤，誘發炎性改變。據研究報道，TNF-

α

基因啟動子含NF-

κ

B位點，激活NF-

κ

B信號通路，NF-

κ

B信號通路是調控炎癥反應的重要通路之一，也是肺纖維化形成的關鍵環節。文獻研究發現，在博來霉素誘導的肺纖維化過程中存在NF-

κ

B過度活化，亞基NF

κ

B p65磷酸化及總NF-

κ

B p65表達增加會釋放過量TNF-

α

、IL-1

β

、IL-6和 IL-10 等炎癥因子，使肺成纖維細胞增殖分化、活力增強，過度產生

α

-SMA，加快肺纖維化病變的程度；

α

-SMA是活化的成纖維細胞的標志，其過度產生導致纖連蛋白、膠原蛋白等細胞外基質的過度分泌，膠原異常分泌是肺纖維化形成的根本原因，故

α

-SMA表達水平的多少判斷纖維化程度。此外，TNF-

α

可直接刺激肺成纖維細胞增殖，合成膠原蛋白，促進肺纖維化進程，因此抑制NF-

κ

B通路激活，減少TNF-

α

的釋放及

α

-SMA的合成是治療肺纖維化的關鍵。本實驗采用Western blot法和免疫組織化學雙重定性定量考察TNF-

α

、NF-

κ

B p65和

α

-SMA蛋白在肺纖維化大鼠肺組織中表達的情況，發現黃芪、知母、黃芪-知母藥對可在不同程度上抑制肺纖維化大鼠TNF-

α

、NF-

κ

B p65和

α

-SMA蛋白表達，其中黃芪-知母藥對治療后肺臟NF-

κ

B P65蛋白表達較單味藥治療更低，這與組織病理學（Masson染色）觀察結果一致。綜上所述，黃芪-知母藥對可減輕肺臟炎癥進而控制纖維化的發展，其機制可能與減少TNF-

α

、TGF-

β

的釋放及

α

-SMA的合成，升高抗炎因子IL-10水平，調控NF-

κ

B信號通路表達有關。本研究僅從炎癥介質調控方面探討了黃芪-知母藥對治療肺纖維化的作用和機制，其他作用機制需進一步研究證實。