巨噬細胞外泌體-脂質體雜化納米粒的制備及表征

鮑倩倩，王強，桑冉，王雷*，陳衛東*（1. 安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012；2.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012；3. 藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，合肥 230012；4. 蚌埠醫學院第一附屬醫院，安徽 蚌埠 233000；5. 蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 233030）

外泌體（exosomes，Exos）是一種幾乎所有類型的細胞都會分泌的細胞外囊泡，其直徑約為100 nm。近年來，Exos作為載藥體系受到了越來越廣泛的關注，與其他載藥系統相比，Exos因源于自體而具有免疫原性低、生物相容性高等特點；更重要的是，Exos具有潛在的靶向能力，有助于提高藥物的靶向能力。但載藥量較低、修飾的靈活性低，且穩定性差等缺點極大地制約了Exos作為藥物載體的進一步開發應用。

脂質體（liposomes，Lips）是磷脂在水中形成的一種具有磷脂雙分子層的囊泡，粒徑一般在40～200 nm。Lips因其載藥性能良好、易于制備和修飾靈活而被作為藥物載體廣泛應用，但Lips屬于外源性物質，易被單核巨噬細胞系統快速清除且靶向性較差。Exos與Lips在結構上相似，都具有脂質雙分子層，粒徑相近；在生理功能上，兩者具有良好的互補性。因此，將這兩種納米囊泡融合形成一個新的雜化納米囊泡可以保留兩者的優點。這種巨噬細胞外泌體-脂質體雜化納米粒（macrophages derived exosomes-liposomes hybrid nanoparticles，MEL NPs）同時具有Exos的內源性和Lips修飾的靈活性，還能提高Exos的穩定性?；诖?，本研究采用超聲法融合Exos與Lips，并對融合后的MEL NPs進行表征，為MEL NPs作為藥物載體的后續研究提供基礎。

1 材料

1.1 儀器

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Tecnai G2 SpirtBiotwin透射電子顯微鏡（美國賽默飛公司）；Nano ZS90馬爾文粒度分析儀（美國馬爾文公司）；anti-JP-1高速低溫離心機、L-90K超高速低溫離心機、CYTOMICS FC 500流式細胞儀（美國貝克曼公司）；F-4600熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；THUNDER 倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清（美國Hyclone公司）；細胞膜橙色熒光探針（DiI）染料（大連美侖生物技術有限公司）；細胞膜紅色熒光探針（DiD）、細胞膜綠色熒光探針（DiO）染料（上海碧云天試劑公司）；3%醋酸雙氧鈾染液（河南銳欣實驗用品有限公司）；膽固醇、蛋黃卵磷脂（上海源葉生物科技有限公司）；泊洛沙姆188（北京金克隆生物技術有限公司）；多聚甲醛、DAPI、抗熒光淬滅劑（安徽Biosharp公司）；一抗稀釋液、HRP標記的山羊抗兔IgG、ECL發 光 液（山 東SparkJade公 司）；TSG101、Alix抗體（成都正能生物公司）。

1.3 細胞

小鼠腹腔巨噬細胞Raw 264.7和肝癌細胞Hepa 1-6購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

小鼠腹腔巨噬細胞Raw 264.7在37℃、5% CO恒溫培養箱中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養。待細胞融合度到80%左右，用不完全培養基繼續培養24 h后，收集細胞上清液。

2.2 Exos提取

采用超高速離心法提取Exos，細胞上清液4℃、300 g離心10 min去除細胞，然后4℃、2000 g離心10 min去除死細胞，4℃、10 000 g離心30 min去除細胞碎片。取上清液4℃、100 000 g離心70 min，所得沉淀即為Exos粗提物。沉淀用PBS重懸后，于4℃、100 000 g離心70 min，所得沉淀用PBS重懸后保存在－80℃備用。

2.3 Lips制備

精密稱取處方量的蛋黃卵磷脂、膽固醇，溶于3 mL無水乙醇中，處方量的泊洛沙姆188溶于50℃預熱的20 mL ddHO中，用1 mL注射器在液面下將溶解完全的有機相緩慢注入至水相中，50℃，1000 r·min攪拌2 h使有機溶劑揮發，即得Lips。

2.4 MEL NPs的制備

采用超聲孵育法制備MEL NPs：取4份Exos（200 μg蛋白）分別與200、1000、2000、4000 μg的Lips混合均勻后用PBS定容至500 μL，80 W超聲10 min（5 s開，5 s關）后，37℃孵育1 h。

2.5 MEL NPs的表征

2.5.1 形態學觀察 各取10 μL的Exos、Lips、MEL NPs稀釋液滴加在銅網上，用1%醋酸雙氧鈾染液進行染色，染色完成后用濾紙吸去多余的染液，在透射電鏡下觀察其形態。

2.5.2 粒徑和Zeta電位 取Lips、Exos、MEL NPs母液，適量稀釋后測定納米囊泡的平均粒徑以及Zeta電位。

2.5.3 外泌體的標志性蛋白檢測 使用適量的RIPA裂解液（含1%PMSF溶液）提取Raw 264.7細胞、Exos以及MEL NPs總蛋白，定量后調整蛋白濃度，100℃煮沸8 min后進行電泳，轉膜，封閉，洗滌和孵育抗體（TSG101和Alix抗體濃度為1∶1000，二抗濃度為1∶12 000），ECL發光液顯影曝光。

2.5.4 熒光共振能量轉移分析 熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指當一個供體熒光基團的發射光譜與受體熒光基團的激發光譜有部分重疊，當兩個基團的距離足夠接近時，處于激發狀態的供體能將其熒光能量轉移給受體，從而激發受體的熒光。膜融合會導致兩個熒光基團的距離增加，FRET效應減弱，供體的熒光強度隨著融合的進行而恢復，相反，受體的熒光強度降低。本研究以DiI作為熒光供體，DiD作為熒光受體，兩者按摩爾比1∶7加至脂質體中得到FRET脂質體，去除游離染料后與Exos融合得到MEL NPs，測量Lips和MEL NPs在550～750 nm的熒光光譜，通過MEL NPs中DiD熒光強度的減弱判斷是否發生融合。

2.6 MEL NPs 的細胞攝取

在MEL NPs中加入適量DiO染料，37℃避光孵育15 min，10 000 g離心10 min初步去除多余的染料，然后將上清液轉移至100 kDa超濾離心管內，10 000 g離心10 min，棄去上清液，加入200 μL PBS重懸，重復3次，即得DiO標記的MEL NPs。

將Hepa 1-6細胞以適宜的密度接種于覆蓋有細胞爬片的12孔板中，待細胞貼壁后，加入DiO標記的MEL NPs共孵育2 h后，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI標記細胞核，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察。

將Hepa 1-6細胞以適宜的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入DiO標記的MEL NPs共孵育2 h后，預冷的PBS洗滌細胞3遍，加入胰酶消化細胞，1200 r·min離心5 min，棄去上清液。預冷的PBS洗滌細胞兩次，棄上清液，PBS重懸，流式細胞儀上機檢測。

3 結果

3.1 MEL NPs的制備條件優化

以粒徑、PDI和FRET效應作為考察指標，考察Exos與Lips的比例對MEL NPs制備的影響，結果見表1。由表1可知，各條件下制備的MEL NPs粒徑均在100 nm左右，尺寸分布比較均勻，穩定性良好。Exos與Lips的比例為1∶1、1∶5和1∶10時，FRET效應減弱，證明Exos與Lips融合成功。研究表明，不同比例的Exos和Lips混合會改變雜化納米粒中Exos和Lips的百分比，且在一定范圍內，隨著Lips比例的增大，雜化納米粒中Lips的比例也會隨之增大。由于MEL NPs的建立是為后期載藥奠定基礎，而藥物是載在Lips中，考慮到載藥量、同時保留Exos的內源性優勢，選擇1∶5進行后續研究。

表1 Exos與Lips的比例對MEL NPs的影響(＝3)
Tab 1 Influence of different Exos to Lips ratios on MEL NPs (＝3)

Exo∶Lips 粒徑/nm PDI FRET效應減弱1∶1 114.83±2.91 0.17±0.02 有1∶5 97.25±2.66 0.20±0.02 有1∶10 115.63±1.60 0.16±0.002 有1∶20 102.56±2.77 0.17±0.02 無

3.2 MEL NPs的表征

3.2.1 形態表征 納米粒的形態見圖1。Lips、Exos與MEL NPs均呈囊泡狀結構，這些納米囊泡大小相似，形態近似球形。

圖1 透射電鏡觀察Lips、Exos和MEL NPs的形態（標尺：200 nm）Fig 1 Morphology of Lips，Exos and MEL NPs were imaged with transmission electron microscopy（scar bar：200 nm）

3.2.2 粒徑及Zeta電位表征 結果見圖2，Lips、Exos和MEL NPs的粒徑分別為（91.79±0.31）nm（PDI＝0.16±0.003）、（127.17±0.45）nm（PDI＝0.22±0.01）和（98.20±0.45）nm（PDI＝0.17±0.02），Zeta電位分別為（－24.53±0.58）mV、（－13.13±0.34）mV和（－16.23±1.00）mV。MEL NPs的粒徑大于Lips，可能是Lips與Exos的融合增加了水分子的相互作用點，從而增加了水化層數。此外，相較于Exos，MEL NPs的電位和PDI有所降低，表明MEL NPs具有良好的尺寸均勻性和穩定性。

圖2 馬爾文納米粒度儀檢測Lips、Exos和MEL NPs的粒徑（A）和Zeta電位分布（B）Fig 2 Size distribution（A）and Zeta potential（B）of Lips，Exos，and MEL NPs measured by dynamic light scattering

3.2.3 Western blot表征 結果見圖3，所提取的Exos和超聲融合后的MEL NPs均表達Alix和TSG101蛋白，且表達量顯著高于Raw 264.7細胞，表明超聲融合不影響外泌體的性質。

圖3 Western blot檢測融合后外泌體標志蛋白的Alix和TSG101的表達Fig 3 Exos markers Alix and TSG101 detected by Western blot after the fusion

3.2.4 FRET表征 結果見圖4，Lips光譜為融合前，MEL NPs光譜為融合后，融合后MEL NPs的DiI熒光強度恢復，DiD熒光強度降低，FRET效應減弱，表明FRET熒光供體和受體之間的距離增加，Lips與Exos成功融合。

圖4 FRET驗證Lips與Exos融合Fig 4 Verify Lips and Exos fusion through FRET

3.3 MEL NPs的細胞攝取

由圖5可知，相比Lips，Hepa 1-6細胞對于MEL NPs的攝取有所增加，表明超聲融合并未破壞Exos的體外靶向能力。

圖5 倒置熒光顯微鏡（A）和流式細胞儀（B）檢測Hepa 1-6 細胞對Lips和MEL NPs的攝取Fig 5 Inverted fluorescence microscope（A）and flow cytometry（B）recorded the uptake of Lips and MEL NPs by Hepa 1-6 cells

4 討論

巨噬細胞是先天性免疫細胞的主要組成部分，其在炎癥調節和腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用。Exos可以攜帶親本細胞的信息，從而具有親本細胞的功能。例如，人巨噬細胞Exos可以攜帶高水平的miR-142和miR-223，在進入肝癌細胞后，抑制肝癌細胞的增殖。M1型巨噬細胞Exos可以誘導腫瘤局部炎性微環境，從而增強紫杉醇的體內抗腫瘤作用。巨噬細胞Exos在腫瘤和炎癥中的重要作用以及其內源性的優點，讓其作為藥物載體受到了研究者越來越廣泛的關注。但Exos載藥量的不足可能會限制其進一步的應用，而Lips在載藥量方面具有顯著優勢，將Exos和Lips融合可以將兩者的優勢結合，同時規避各自的劣勢。這種混合膜雜化納米粒載藥系統近年來受到了國內外學者的廣泛關注。Rayamajhi等將巨噬細胞來源的小細胞外囊泡與負載阿霉素的Lips融合，制備出具有靶向能力且可在酸性條件下pH敏感性釋放藥物的混合膜雜化納米粒。Cheng等將過表達CD47的CT26細胞Exos與負載光熱劑的熱敏Lips融合制備混合膜雜化納米粒，該雜化納米粒可以通過競爭性結合SIRP

α

來增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，并可以通過近紅外激光照射光熱劑消融腫瘤細胞，具有優異的體內外抗腫瘤效果?；旌夏るs化納米粒載藥系統同時具有Exos和Lips的優點，表現出優異的靶向性，高載藥量和對單核巨噬細胞系統的逃避，是一種很有應用前景的載藥系統。

Exos的提取方法主要有超高速離心法、免疫親合法、PEG沉淀法、尺寸排阻色譜法和微流體技術等，其中超高速離心法因操作簡單，成本相對低廉并且獲得的Exos純度較高而被廣泛使用。

MEL NPs的制備方法主要有孵育法、超聲法、反復凍融法，所有這些技術在Exos特性的保持方面各有優劣，孵育法可能導致制備的MEL NPs顆粒粒徑不均一，而反復凍融過程中Exos蛋白可能遭到破壞。本研究采用超聲法制備MEL NPs，通過馬爾文粒度分析儀、透射電鏡、熒光分光光度計、Western blot、倒置熒光顯微鏡以及流式細胞儀對其進行了一系列表征，發現超聲融合在未破壞Exos內源性優勢的同時提高其穩定性，這為其作為藥物載體進行進一步研究提供了一定的基礎。