血塞通滴丸整合溶出度測定方法的建立

閆偉偉，羅慧玉，唐殿飛，丁杰，陳正源（張家口市食品藥品檢驗中心，河北 張家口 075000）

血塞通滴丸是由三七總皂苷提取物應用固體分散技術制成的制劑，具有活血祛瘀、通脈活絡等多種功效。臨床上多用于治療中風偏癱、心脈腦絡癖阻、胸痹、心絞痛及腦血管病后遺癥等多種病癥。查閱資料發現，目前已有關于血塞通滴丸臨床應用、制備工藝、定性鑒別及含量測定等方面的研究，但未涉及到溶出度相關報道。溶出度是模擬口服固體制劑在胃腸道中的崩解和溶出情況用來評價制劑活性成分的體內生物利用度和藥物的內在品質，會影響藥物的吸收并反映制劑的工藝。本試驗以三七總皂苷中的三七皂苷R、人參皂苷Rg、人參皂苷Re、人參皂苷Rb和人參皂苷Rd 為指標成分，通過質量權重系數法對皂苷組分進行溶出度整合并以此表征其整體溶出情況，為血塞通滴丸的溶出度檢測提供準確可行的檢驗方法，為其質量控制及評價提供參考。

1 材料

LC-2010A HT型高效液相色譜儀（島津公司）；CPA225D分析天平（德國賽多利斯集團，感量：0.01 mg）；RCZ-8M溶出儀（天大天發科技有限公司）；Milli-Q Integral純水/超純水機（美國Millipore 公司）。血塞通滴丸信息見表1。對照品三七皂苷R（批號：110745-201921，純度：90.4%）、人參皂苷Rg（批號：110703-201530，純度：91.7%）、人參皂苷Re（批號：110754-202028，純度：93.9%）、人參皂苷Rb（批號：110704-202028，純度：93.1%）和人參皂苷Rd（批號：111818-201603，純度：92.1%）（中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀、醋酸鈉均為分析純，水由超純水機制備。

表1 血塞通滴丸樣品信息
Tab 1 Sample information of Xuesaitong dropping pills

編號 廠家 批號 生產年份A-1 朗天藥業 20190401 2019 B-1 昆藥集團 181004 2018 B-2 昆藥集團 191243 2019 B-3 昆藥集團 200113 2020 C-1 神威藥業 19082721 2019

2 方法與結果

2.1 色譜條件[10-11]

色譜柱：Thermo C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（0～21 min，22% 乙 腈；21～45 min，22%～48%乙腈；45～55 min，48%～55% 乙 腈；55～60 min，55% 乙腈；60～62 min，55%～22%乙腈；62～72 min，22% 乙腈）；流速：1.0 mL·min；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL，記錄色譜圖（見圖1）。

圖1 混合對照品（A）和供試品溶液（B）的HPLC圖Fig 1 HPLC of mixed reference（A）and sample solution（B）

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取三七皂苷R及人參皂苷Rg、Rb、Rd對照品各22.90、23.32、22.40、21.82 mg，分別置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質量濃度分別 為4.1403、4.2769、4.1709、4.0192 mg·mL的對照品儲備液；另精密稱取人參皂苷Re對照品13.37 mg置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質量濃度為0.5022 mg·mL的人參皂苷Re對照品儲備液。精密量取上述各儲備液適量置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，得三七皂苷R0.041 40 mg·mL，人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd質量濃度分別為 0.1634、0.016 72、0.1564、0.050 24 mg·mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 以脫氣后的200 mL水為溶出介質，轉速為50 r·min，照溶出度測定法《中國藥典》2020年版四部通則0931溶出度測定方法第三法（小杯法）操作；取滴丸10粒，共6份，稱定質量后投入溶出杯中，立即啟動溶出儀并計時。于2、5、8、10、15、20、25、30、45 min分別取樣，每次1 mL，同時補充等量同溫度的水，各時間點溶出液置0℃以下放置30 min，待基質析出后，迅速濾過，即得。

2.2.3 含量測定溶液的制備 取本品50 粒，精密稱定質量，計算平均粒重，研細，取約相當于10粒質量的粉末，精密稱定，置于200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置0℃以下放置30 min，待基質析出后，迅速濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下各對照品儲備液適量，加甲醇分別稀釋制成不同質量濃度的對照品溶液，進樣測定，以峰面積為縱坐標（

Y

），質量濃度（mg·mL）為橫坐標（

X

）繪制標準曲線，結果見表2。

表2 各指標成分的線性方程和相關系數
Tab 2 Linear regression equation and related coefficient of index components

成分 線性方程 R2 線性范圍/（mg·mL－1）三七皂苷R1 Y＝6.53×106X＋1.16×104 0.9996 0.005 18～0.207人參皂苷Rg1 Y＝8.03×106X－5.18×104 0.9991 0.0107～0.534人參皂苷Re Y＝6.49×106X－3.46×103 0.9995 0.002 51～0.0502人參皂苷Rb1 Y＝4.69×106X＋1.41×104 0.9994 0.0130～1.043人參皂苷Rd Y＝5.84×106X－2.58×103 0.9997 0.003 36～0.502

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，連續進樣6次，三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分別為 0.28%、0.63%、0.56%、0.40% 和0.72%，表明儀器精密度良好。2.3.3 重復性試驗 取“2.2.2”項下的15 min溶出液（批號：200113）共6份，進樣檢測，結果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分 別 為1.3%、1.3%、1.8%、1.5%和1.9%，表明方法重復性良好。2.3.4 穩定性試驗 取“2.2.2”項下的15 min溶出液（批號：200113），分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，結果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分別為0.86%、0.62%、1.1%、1.1% 和0.91%，表明供試品溶液在24 h內穩定。2.3.5 加樣回收試驗 取批號為200113樣品，精密稱定6份，每份約0.2447 g，分別置于25 mL量瓶中，按大致1∶1比例進行加樣，用甲醇稀釋至刻度，濾過，精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，0℃以下放置30 min，待基質析出后，濾過，進樣，記錄色譜峰并計算回收率。結果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd的平均回收率分別為99.68%、99.60%、98.36%、97.60%、97.99%，

RSD

分別為0.69%、0.62%、0.64%、0.46%、0.73%。

2.4 溶出度計算

2.4.1 溶出度計算 以各時間點溶出液的色譜峰面積按線性方程計算該成分的溶出量（

M

），公式中

C

為某時間點的質量濃度（mg·mL），

V

為溶出介質體積（mL），

V

為取出液體積（mL）。取“2.2.3”項下溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品峰面積，計算各指標成分的含量（以mg·g計），含量乘以溶出樣品的質量計算該成分的累計溶出量（

M

）。溶出度公式為：

Q

＝

M/M

×100%，

Q

為

t

時間某成分的溶出度。

2.4.2 整合溶出度計算 中藥具有多組分、整體論治的特點，僅靠對單一活性藥物成分進行溶出行為的考察指標評價其質量，不能全面體現中藥多成分協同作用的特點。本試驗參考文獻，通過引入質量權重系數，以質量分數為各指標項的權重系數（即質量分數權重系數）綜合表征血塞通滴丸皂苷組分的溶出度，以客觀真實地反映血塞通滴丸皂苷組分的整體溶出情況。其中，以皂苷組分的質量分數為整體單位，即為質量權重系數參照，各指標成分質量權重系數為該成分與組分質量分數之比。各成分質量權重系數公式如下：

φ

=（933.13/4737.72）×100%＝19.70%，

φ

=（801.01/4737.72）×100%＝16.91%，

φ

=（917.14/4737.72）×100%＝19.99%，

φ

=（1109.29/4737.72）×100%＝23.41%，

φ

=（947.15/4737.72）×100%＝19.99%。根據每一時間點下5種指標成分的溶出度（

Q

）與各自的權重系數，計算血塞通滴丸在該時間點下的整合溶出度，則

Q

＝

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

。

2.5 溶出條件的選擇

2.5.1 溶出介質的選擇 以批號為200113的血塞通滴丸為研究對象，采用小杯法測定，固定其他條件不變，分別考察了水、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質時的整合溶出度，以該樣品在3種溶出介質中的整合溶出度為縱坐標、溶出時間為橫坐標，繪制3種介質中的整合溶出曲線，見圖2。結果表明溶出介質的改變對整合溶出度影響較大，選擇水作為溶出介質時，血塞通滴丸溶出迅速，在樣品達到溶出平衡后，整合溶出度最大，因此確定水作為溶出介質。

圖2 血塞通滴丸在不同介質中的整合溶出度Fig 2 Integrated dissolution in different dissolution media of Xuesaitong dropping pills

2.5.2 轉速的選擇 按擬定溶出條件，采用小杯法測定，固定其他條件不變，以50 r·min與75 r·min進行轉速篩選，結果表明兩種轉速條件下的整合溶出度比較接近，且在50 r·min轉速下15 min時整合溶出度即可達85%，因此確定轉速為50 r·min。

2.5.3 限度和取樣時間的選擇 以B廠家的3批次樣品為研究對象，按擬訂條件進行累計溶出度測定，結果見圖3。根據文獻確定溶出度取樣時間點為溶出曲線中第一次連續兩點平均溶出度均在85%以上，且此兩點溶出度的平均值之差在5% 以內（即“平臺期”）時的第一時間點，并將該點溶出度減去15%作為溶出限度。本實驗的3批次樣品在15 min時溶出趨于平穩，溶出度在85%以上，故確定取樣時間點為15 min，同時，該點的溶出度減去15%為77.03%，確定溶出限度為75%。

圖3 B廠家樣品整合溶出度曲線Fig 3 Integrated dissolution curve of samples from manufacturer B

2.6 溶出曲線繪制與比較

以批號為200113的血塞通滴丸為研究對象，繪制了5種指標成分溶出度與整合溶出度的溶出曲線，結果見圖4；以整合溶出度為參比，采用非模型依賴的相似因子（

f

）法比較各成分溶出曲線的相似性。

f

的計算公式為：

圖4 5種指標成分與整合溶出度溶出曲線Fig 4 5 indexes and integrated dissolution curve

公式中

n

為時間點個數，

R

為參比樣品（或變更前樣品）在

t

時刻的溶出度值，

T

為試驗批次（變更后樣品）在

t

時刻的溶出度值。

f

越接近100，相似度越高；當

f

在50～100時，表示溶出行為相似，無顯著性差異。通過計算，本樣品中三七皂苷R及人參皂苷Rg、Re、Rb和Rd 的

f

因子分別為76.2389、80.3563、70.7574、80.9373和62.0467，均大于50，表明整合溶出曲線與5種指標成分的溶出曲線相似性較好，可以反映血塞通滴丸皂苷組分的整體溶出情況。

2.7 溶出模型擬合與比較

取批號為200113血塞通滴丸，采用不同的模型進行擬合，推測藥物溶出機制，結果見表3，以Weibull模型最好。選用Weibull模型計算該批次樣品溶出參數

T

、

T

和

T

，結果分別為3.87 min、5.19 min和12.33 min，表明血塞通滴丸在15 min內溶出度可達到85%以上，可實現速效的目的。

表3 整合溶出度擬合結果
Tab 3 Fitting of integrated dissolution

模型 擬合方程 R2零級釋放方程 Q＝1.4905t＋48.5300 0.4996一級釋放方程 ln（1－Q）＝－0.0637t＋3.8157 0.6993 Weibull方程 ln[1/（1－Q）]＝1.0383lnt－5.3163 0.9267 Peppas方程 lnQ＝0.6107lnt＋2.6312 0.7680 Higuchi方程 Q＝14.3210t1/2＋19.0630 0.6826

2.8 樣品測定

按擬定溶出度測定方法對3個企業5批次血塞通滴丸樣品進行溶出度試驗，平均整合溶出度見表4，不同企業的血塞通滴丸樣品在15 min時溶出度均已達到所設定的限度要求。

表4 5批血塞通滴丸溶出度試驗測定(＝6)
Tab 4 Dissolution of 5 batches of Xuesaitong dropping pills (＝6)

批號 整合溶出度/% RSD/%20190401 90.36 0.85 181004 92.06 1.26 191243 92.03 1.08 200113 92.20 1.35 19082721 86.03 0.95

3 討論

由于血塞通滴丸樣品中每粒滴丸含三七總皂苷較少，5種指標成分含量相對較低，為提高準確度，本試驗選擇考察10粒血塞通滴丸的溶出度，同時選擇小杯法，溶出介質體積選擇 200 mL，以降低試驗偏差。有文獻報道三七總皂苷在pH 1.0鹽酸溶液中不穩定，易發生水解而生成脂溶性苷元；在預試驗時，課題組以pH 1.2鹽酸溶液為溶出介質時，有部分成分色譜峰未檢測到，故本試驗僅選用pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水進行溶出曲線的測定及溶出介質的篩選。

為使各色譜峰與相鄰峰分離度大于1.5，本試驗參考文獻并進行優化，確定以乙腈-水流動相系統進行梯度洗脫，取得了滿意的分離效果，且理論板數按人參皂苷Rg計算大于6000。本試驗同時對比了各指標成分的含量與溶出60 min后快速攪拌30 min（250 r·min）的最大溶出量的差異以確定完全溶出點，結果兩種方法含量無明顯差別，故確定以制劑自身含量為完全溶出點，作為溶出度的計算參照，以準確反映樣品的真實溶出度。

滴丸制劑在制備過程中混有不同比例的聚乙二醇等成型基質，容易對儀器及系統造成嚴重損害，根據血塞通滴丸含量測定方法，將樣品溶液置于0℃以下30 min，待基質析出后再過濾進樣可減少對儀器的損害。