植煙土壤中枯萎病菌和黑脛病菌的快速檢測(cè)方法

張紀(jì)利，齊 是，欒新博，金亞波，黃崇峻，黎 平，韋建玉，顏 健

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530001；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)與循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】眾所周知，植物病原微生物在植株根際定殖的數(shù)量是決定能否侵染植株的關(guān)鍵，所以土傳病害的發(fā)生是與土壤中病原菌數(shù)量變化呈一定關(guān)系的［1-2］。一般認(rèn)為，土傳病原菌存在于土壤中，當(dāng)土壤中病原菌數(shù)量激增對(duì)植株的侵染就會(huì)越發(fā)嚴(yán)重，待病原菌突破植株的自身防御體系便可以引發(fā)土傳病害。因此，在種植初期和發(fā)病早期對(duì)潛伏在土壤中的病原菌數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于監(jiān)測(cè)田間病害的發(fā)生，并針對(duì)性的選擇化學(xué)或者生物等防控技術(shù)手段，將病原菌數(shù)量控制在發(fā)病閾值內(nèi)，從而減小經(jīng)濟(jì)損失［3］。

【前人研究進(jìn)展】目前，常用的病原菌檢測(cè)方法主要包括分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和LAMP 技術(shù)等［4-6］。相對(duì)于普通PCR，熒光定量PCR（qPCR）靈敏度更高，具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、假陽(yáng)性低、可量化等優(yōu)點(diǎn)。此外，qPCR 可以檢測(cè)到土壤中無(wú)法分離培養(yǎng)的微生物，從而克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性。qPCR 是在普通PCR 反應(yīng)體系中加入特定的熒光結(jié)合物或熒光探針，然后通過(guò)特定的熒光識(shí)別儀器，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，得到模板基因通過(guò)擴(kuò)增達(dá)到熒光檢測(cè)閾值所需的循環(huán)數(shù)（Ct 值），再根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定模板中的基因表達(dá)量，推導(dǎo)出在目標(biāo)樣本內(nèi)病原菌的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的定量［7］。……