新型含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的羥胺類熒光探針的合成及其在醛類化合物檢測中的應用

朱 灝, 張文清, 杜傳元, 朱芳芳, 胡曉松, 劉亞群

(武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070)

醛類化合物廣泛存在于食物[1-6]、飲料[7-12]、生態(tài)環(huán)境[13-16]和生物系統(tǒng)中[17-22]，它們的含量對于人體健康和人類的生活質(zhì)量有深遠影響。以食品工業(yè)為例，醛類化合物的含量是食品質(zhì)量評價體系的重要指標之一。低含量的醛類物質(zhì)的存在能提供食品令人愉悅的風味，而當醛類物質(zhì)的含量過高時會加速食品的變質(zhì)。糠醛(F)、 5-甲基糠醛(5-MF)、 5-羥甲基糠醛(5-HMF)廣泛存在于各種食品中，其含量是其新鮮度和質(zhì)量的重要指標[2,5,10,12]，因此醛類物質(zhì)的定量分析和檢測具有重要的研究意義。目前已經(jīng)有基于紫外-可見吸收光譜分析、核磁共振分析、氣相色譜分析等醛類化合物的檢測方法[23-27]，但它們受到低選擇性、基質(zhì)效應或者復雜的前處理等多方面的限制。基于柱前熒光衍生的高效液相色譜分析法是目前理想的醛類化合物檢測手段，熒光衍生可以增強被分析物的疏水性和光譜響應。解決了大部分醛類化合物由于缺少發(fā)色團或熒光團帶來的檢測上的困難。

香豆素結(jié)構(gòu)廣泛存在于自然界的許多植物中[28-29]，因其具有體積小、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大，容易合成與修飾等優(yōu)點，常被應用于熒光探針的設計與合成中[30-40]。含香豆素熒光團的衍生試劑已經(jīng)在醛類化合物的定量分析中得到了廣泛的應用[34-40]。熒光衍生試劑除了需要具備良好的熒光團以外，其分子結(jié)構(gòu)中還必須具備可以在溫和條件下快速與被分析物質(zhì)發(fā)生化學反應的基團。由于羥胺能與醛類物質(zhì)進行硝酮化或者肟化反應的特征，含羥胺結(jié)構(gòu)的化合物也被應用于常見醛類物質(zhì)和糖類物質(zhì)的檢測中[38-40]。羥胺結(jié)構(gòu)在有機化學中十分重要，被應用于許多經(jīng)典的有機反應之中[41-44]。傳統(tǒng)的N-取代羥胺化合物的合成方法仍是依靠拉西合成，電解還原，肟化水解等傳統(tǒng)工藝[38,45-47]。這些方法普遍存在能耗大，所需設備多，工藝流程長，反應條件苛刻，環(huán)境污染嚴重等問題，因而復雜的羥胺化合物難以得到廣泛的合成與應用。Rinske等在2013年提出了一種新的合成方案[48]，將鹵代烴與N，O-雙叔丁氧羰基(Boc)羥胺進行反應，得到的產(chǎn)物再通過鹽酸水解，就可以得到N-羥胺鹽酸鹽。該種方法條件溫和，原料易得，副產(chǎn)物較少，適合于設計合成較為復雜的N-羥胺衍生物。

Taran課題組發(fā)現(xiàn)[49]，悉尼酮(又稱斯德酮)這種特殊的介離子化合物可以與炔烴進行點擊反應，形成帶有吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。該反應相比于傳統(tǒng)的Husigen環(huán)加成反應具有許多明顯的優(yōu)勢：可以避免使用較為危險的疊氮化合物，同時悉尼酮的反應活性更高，反應速率更快。除此之外，原本的香豆素-悉尼酮衍生物幾乎沒有熒光，但與炔烴進行點擊反應之后得到的吡唑香豆素產(chǎn)物的熒光性能優(yōu)異[49]。因此，該類反應近年來多應用于細胞成像等領(lǐng)域[49-52]。

以這些工作為基礎(chǔ),本課題組設計并合成了兩種含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的羥胺類熒光探針10和11(Scheme 1和Scheme 2)：先根據(jù)文獻中的方法[52]，以4-甲氧基水楊醛和N-乙酰甘氨酸為原料，合成了3-氨基-7-甲氧基香豆素3，3與溴乙酸進行取代反應，得到香豆素羧酸中間體4,4與亞硝酸叔丁酯和三氟乙酸酐反應，生成香豆素-悉尼酮結(jié)構(gòu)的母體化合物5。含炔基的化合物6和化合物7由溴丙炔和含Boc結(jié)構(gòu)的羥胺反應制備[48]，再與悉尼酮進行點擊反應，得到含有香豆素吡唑結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物化合物8和化合物9，最后用鹽酸脫去Boc保護基生成目標產(chǎn)物10和11。相關(guān)的應用研究以N-取代羥胺為例，與糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛進行了熒光衍生，通過高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)以及HR-MS(高分辨質(zhì)譜)進行表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點測定儀；Thermo fisher Q-Exactive型質(zhì)譜儀；Nicolet iS5型紅外光譜儀 (KBr 壓片)；LS55型熒光分光光度計；Bruker AVANCE III 500 MHz NMR型核磁共振儀(氘代二甲亞砜和氘代氯仿為溶劑，TMS為內(nèi)標)。

所用試劑均為分析純或化學純；實驗用水為屈臣氏桶裝蒸餾水；衍生分析部分涉及到的溶劑均為色譜純。

Scheme 1

Scheme 2

1.2 合成

(1) 化合物3的合成

將二環(huán)己基碳二亞胺(2.48 g, 12.0 mM)和N-乙酰甘氨酸(2.81 g, 24.0 mM)加入至二氯甲烷(40 mL)中攪拌過夜。過濾掉生成的固體并用二氯甲烷(30 mL)沖洗濾渣。合并濾液和洗液，旋蒸濃縮得到白色固體，固體溶解于N,N-二甲基甲酰胺(12 mL)中后，加入4-甲氧基水楊醛(913 mg, 6.0 mM)和乙酸鈉(738 mg, 9.0 mM)。將得到的混合物在120 ℃下回流1 h。溶液冷卻至室溫，加水生成大量黃色固體。過濾，濾渣依次用水(30 mL)和冷乙醇(10 mL)洗滌得到7-甲氧基-3-乙酰氨基香豆素。不經(jīng)進一步純化，化合物溶解于濃鹽酸(20 mL)、乙醇(10 mL)和水(10 mL)的混合物中。回流反應1 h。冷卻至室溫，加入碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生。過濾，沉淀用水(100 mL)洗滌，真空干燥得黃色固體化合物3859 mg，產(chǎn)率75%， m.p.137～139 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.20(d,J=9.4 Hz, 1H), 6.82～6.81(m, 2H), 6.70(s, 1H), 4.05(s, 2H), 3.84(s, 3H);13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ: 159.9, 159.2, 150.5, 129.9, 126.0, 114.6, 112.7, 112.4, 100.9, 55.8; IRνν: 1705, 1646, 1622, 1591, 1506, 1440, 1304, 1272, 1253 cm-1; MSm/z: calcd for C10H10NO3{[M+H]+}192.0661, found 192.0649。

(2) 化合物4的合成

將化合物3(180 mg, 0.94 mM)和溴乙酸(130 mg, 0.94 mM)加入至水10 mL中，在95 ℃下反應3 h。冷卻至室溫過濾，用水和二氯甲烷洗滌濾渣，干燥后得到化合物495 mg，淡棕色固體，產(chǎn)率41%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.32(d,J=9.3 Hz, 1H), 6.83～6.86(m, 2H), 6.48(s, 1H), 3.93(s, 2H), 3.82(s, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 171.2, 158.7, 157.9, 148.6, 130.5, 126.0, 114.7, 112.4, 106.1, 100.5, 55.6, 44.6; IRν: 3285, 1703, 1633, 1513, 1421, 1274, 1248, 1196, 1159 cm-1； MSm/z: calcd for C12H10NO5{[M+H]+}248.0564, found 248.0564。

(3) 化合物5的合成

將亞硝酸叔丁酯(0.03 mL, 0.25 mM)滴加至化合物4(51 mg, 0.2 mM)的四氫呋喃(3 mL)溶液中，并在室溫下攪拌1.5 h之后，加入三氟乙酸酐(0.03 mL, 0.25 mM)繼續(xù)反應1.5 h。反應結(jié)束后，用飽和的NaHCO3水溶液10 mL淬滅混合物。有機相用(3×15 mL)的二氯甲烷萃取，合并后用無水Na2SO4干燥，旋蒸濃縮。采用硅膠柱層析的方法進行提純分離(EA∶CH2Cl2=5∶95)得到化合物535 mg，黃色固體，產(chǎn)率68%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.45(s, 1H), 7.61(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.32(s, 1H), 7.03(dd,J=8.7 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.94(d,J=2.3 Hz, 1H), 3.96(s, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 168.8, 166.0, 156.4, 154.5, 138.2, 131.2, 116.8, 115.2, 110.4, 101.1, 97.4, 56.4; IRν: 3285, 1703, 1633, 1513, 1421, 1274, 1248, 1196, 1159 cm-1; MSm/z: calcd for C12H9N2O5{[M+H]+}261.0506, found 261.0504。

(4) 化合物6的合成

將溴丙炔(0.980 mg, 7.36 mM)緩慢滴入至溶解有N-羥基氨基甲酸叔丁酯(0.967 g, 7.72 mM)和碳酸鈉(1.560 g, 14.7 mM)的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，加熱至70 ℃攪拌過夜。反應結(jié)束后混合物加入適量水，用乙酸乙酯萃取三次。有機相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥后真空濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化 (PE∶EA=10∶1)得化合物6510 mg，無色油狀液體, 產(chǎn)率41%;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 4.34(br.s, 2H), 2.36(t, 1H), 1.34(s, 9H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 156.4, 82.1, 78.2, 75.6, 63.7, 28.2(3C); IR(KBr)ν: 3291, 2980, 1725, 1478, 1393, 1369, 1251, 1166 cm-1; MSm/z: calcd for C8H14NO3{[M+H]+}172.0968, found 172.0964。

(5) 化合物7的合成

將溴丙炔(80%甲苯溶液, 0.23 mL, 2.07 mM)滴加至N,O-二Boc-羥胺(0.435 g, 1.86 mM)和K2CO3(0.343 g, 2.48 mM)的DMF(15mL)溶液中。混合物常溫攪拌反應16 h后加入水(100 mL)，乙酸乙酯(2×50 mL)萃取混合物。有機相合并后依次用水(2×100 mL)和飽和食鹽水(100mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得到化合物70.304 g為無色油狀液體，產(chǎn)率60%；1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 4.31(br.s, 2H), 2.26(t, 1H), 1.51(s, 9H), 1.48(s, 9H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 154.5, 151.9, 84.9, 83.3, 76.9, 72.6, 40.4, 28.0(3C), 27.5(3C); IR (KBr)ν: 3293, 2982, 1787, 1726, 1477, 1371, 1280, 1232 cm-1; MSm/z: calcd for C13H22NO5{[M+H]+} 272.1498, found 272.1500。

(6) 化合物10的合成

將化合物5(200 mg, 0.812 mM)與化合物6(166 mg, 0.896 mM)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(8 mL)中，再配置含有五水合硫酸銅(40.6 mg, 0.164 mM)、 BPDS(4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸二鈉鹽水合物, 87.2 mg, 0.164 mM)以及三乙醇胺(121.6 mg, 0.812 mM)的水溶液，并加入至上述的DMF溶液中，最后再加入抗壞血酸鈉(321.7 mg, 1.824 mM)，50 ℃下攪拌反應40 min。反應結(jié)束后加入0.05 M HEDTA水溶液(50 mL)，用乙酸乙酯萃取3次。有機相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥后真空濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(PE∶EA=3∶1)得131 mg白色粉末8。取100 mg化合物8溶解于鹽酸-乙酸乙酯混合溶液6 mL中(V∶V=1∶5)， 30 ℃下反應，用TLC監(jiān)測反應進程，待原料消失后停止反應，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得化合物1065 mg為白色粉末，產(chǎn)率78%， m.p. 186～188 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 10.99(s, 3H), 8.53(s, 1H), 8.50(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.83(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.13(s, 1H), 7.05(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 5.04(s, 2H), 3.89(s, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 163.0, 156.8, 154.0, 142.2, 132.5, 130.5, 123.0, 115.8, 113.8, 112.3, 100.9, 87.0, 56.5; IRν: 2989, 2975, 1689, 1622, 1514, 1445, 1399, 1045 cm-1; MSm/z: calcd for C14H14N3O4{[M]+}288.0984, found 288.1016。

(7) 化合物11的合成

將化合物5(200 mg, 0.812 mM)與化合物7(280 mg, 0.896 mM)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(8 mL)中，再配制含有五水合硫酸銅(40.6 mg, 0.164 mM)、 BPDS(4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸二鈉鹽水合物87.2 mg, 0.164 mM)以及三乙醇胺(121.6 mg, 0.812 mM)的水溶液，并加入至上述的DMF溶液中，最后再加入抗壞血酸鈉(321.7 mg, 1.824 mM)，50 ℃下攪拌反應40 min。反應結(jié)束后加入0.05 M HEDTA水溶液(50 mL)，用乙酸乙酯萃取三次。有機相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥后真空濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(PE:EA=3:1)得180 mg淡黃色液體9。取100 mg化合物9溶解于鹽酸-乙酸乙酯混合溶液6 mL中(V:V=1:5)，于30 ℃反應至終點，用TLC監(jiān)測反應進程。待原料消失后停止反應，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得化合物1152 mg為白色粉末，產(chǎn)率82%， m.p.215～216 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 11.59(br. s, 1H), 10.99(br. s, 1H), 8.57(s, 1H), 8.51(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.83(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.12(s, 1H), 7.05(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 4.32(s, 2H), 3.89(s, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 163.0, 156.8, 154.0, 142.8, 133.0, 132.2, 130.5, 123.0, 113.8, 112.3, 111.7, 100.9, 56.5, 44.8; IRν: 2971, 2901, 1717, 1605, 1508, 1442, 1402, 1066 cm-1; MSm/z: calcd. for C14H14N3O4{[M]+}288.0984, found 288.1018。

1.3 探針的熒光量子產(chǎn)率測定

根據(jù)文獻報道[46]及實驗結(jié)果顯示，香豆素-悉尼酮的原母體結(jié)構(gòu)幾乎不產(chǎn)生熒光， 但在與炔基化合物進行點擊反應以后，其熒光性能會得到大大增強，熒光量子產(chǎn)率有明顯提高。采用1 μM硫酸奎寧(溶于0.1 M硫酸溶液)作為標準參照物，將1 mM 羥胺溶液用水溶液稀釋成1 μM，然后對其進行相關(guān)檢測。

1.4 探針分子對糠醛的定量衍生分析

工業(yè)上糠醛檢測所采用的國標法即為鹽酸羥胺肟化法[55]，但是該方法誤差大，配制標準溶液的耗時較長，因而存在很大的局限性。為此，根據(jù)合成的羥胺熒光探針的特性，以N-取代羥胺探針11為例，設計了新的驗證探針分子與糠醛定量衍生的方法，詳細步驟為：在1.5 mL EP管中依次加入40 μL 探針溶液(0.2 mM，去離子水溶解)、20 μL醛的標準溶液(0.2 mM，純甲醇溶解)和20 μL 2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(40 mM，純甲醇溶解)，最后加入20 μL甲醇，混勻后置于20 ℃下反應40 min。反應后的混合物取10 μL直接注射進色譜系統(tǒng)中，高效液相色譜采用梯度洗脫模式，洗脫程序如表1所示，其中流動相A為乙腈-水(0.2/0.8,V/V)，流動相B為乙腈-水(0.5/0.5,V/V)。A、B相中均加入0.02 M的乙酸和0.01 M的乙酸鈉，流速為1 mL/min。熒光檢測器激發(fā)波長設為340 nm，發(fā)射波長設為407 nm，柱溫箱為常溫。

表1 梯度洗脫的時間程序

1.5 方法學驗證試驗

熒光定量分析的回歸方程通過以下方法獲得：選取濃度范圍從定量限(LOQ)到4 μM的糠醛樣品用于熒光衍生，然后線性擬合熒光衍生物所對應的色譜峰的面積和相應的濃度得到回歸方程和對應的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

1.2 合成

本文合成的吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針，與只含有香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針相比，不僅有更優(yōu)異的熒光性能，同時合成的香豆素-悉尼酮熒光砌塊(化合物5)可以與多種炔基化合物發(fā)生點擊反應，更利于與多種不同的反應基團進行連接，合成出一系列檢測不同小分子的含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針。

λ/nm

λ/nm圖1 化合物10和11的熒光譜圖

Figure 1FL spectra of 10 and 11

最初的實驗方案是直接將含有兩種羥胺結(jié)構(gòu)的端炔與悉尼酮-香豆素進行點擊反應得到所需要的熒光探針，但是羥胺存在極性較大、活性較高的問題，對點擊反應產(chǎn)生了干擾。于是本實驗采用引入保護基的方案來減少點擊反應中副反應的發(fā)生，在經(jīng)過多次嘗試后，最終選擇并合成了含有Boc基團的炔基化合物6和7，以便于點擊反應能夠順利進行，同時提高產(chǎn)率，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

N-取代羥胺合成的傳統(tǒng)方法一般通過醛類化合物發(fā)生肟化反應得到含有肟式結(jié)構(gòu)的中間體，然后與強還原劑發(fā)生還原反應得到相應的羥胺化合物(Scheme 3)。該類反應往往條件復雜，副產(chǎn)物較多，不利于較為復雜的羥胺化合物的合成。而本文采用的方案較為簡便，條件溫和，有望用于其他N-取代羥胺化合物的合成之中。

2.2 10與11的熒光光譜及熒光量子產(chǎn)率

化合物10與11的熒光光譜見圖1。由圖1可知，兩種化合物的斯托克斯位移分別為67 nm和68 nm，相應的物理常數(shù)見表2。綜合圖1和表2可知，新合成的含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的探針具有良好的熒光量子產(chǎn)率。

Time/min

2.3 化合物11與糠醛的衍生分析結(jié)果

化合物11與糠醛的衍生結(jié)果如圖2所示。相較于空白樣，在加入混合糠醛以后，色譜圖中分別在12 min、 18 min、 22 min出現(xiàn)了3個新峰，對應的是3種糠醛的具有硝酮結(jié)構(gòu)的衍生產(chǎn)物(N-取代羥胺基香豆素與呋喃醛的硝酮化反應)。這與其他研究報道的結(jié)果類似[38-40,56-57]。而其他常用的檢測試劑，例如2,4-二硝基苯肼(DNPH)和鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)在與糠醛類物質(zhì)反應時，在色譜圖上會有兩個主要的衍生產(chǎn)物峰。根據(jù)肟化反應原理，這兩種衍生試劑在與羰基類物質(zhì)反應時會生成順-反兩種異構(gòu)體[38-40,58-59]，而本文設計的方法只生成單一的衍生產(chǎn)物峰，且具有較高的靈敏性，因此可用于準確測定糠醛類物質(zhì)。

隨后，繼續(xù)通過質(zhì)譜分析，進一步證實了衍生產(chǎn)物的生成。質(zhì)譜圖(圖略)中的衍生物質(zhì)譜峰信號強烈，表明吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)中兩個氮原子的存在有助于質(zhì)譜的離子化。因此，本文合成的香豆素吡唑羥胺熒光探針也有望在單獨基于質(zhì)譜分析的醛類物質(zhì)檢測中發(fā)揮重要作用。

表3 硝酮化反應分析糠醛混合物所得線性范圍、線性方程、檢出限和相對標準偏差

2.2 方法學驗證

本分析方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和檢出限如表3所示。由表3可知，以3種糠醛定量限(LOQ， S/N=10)的濃度到 4000 nM 為線性范圍，在此范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997～0.9999；檢測限(LOD， S/N=3)為0.4～0.8 nM，能夠滿足食品中糠醛類化合物含量的檢測。

以香豆素-悉尼酮為熒光合成砌塊，通過它與Boc基團保護的炔基羥胺的點擊化學反應最終得到了兩種具有吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的羥胺類熒光探針。由于吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的存在，其熒光性能良好，N-取代和O-取代探針的熒光量子產(chǎn)率分別達到0.72和0.76。之后以N-取代羥胺為例，分別與食品中常見的糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛進行了熒光衍生，并用HPLC-FLD以及HR-MS進行了分析表征。初步的研究結(jié)果表明：三種糠醛衍生后形成的硝酮化合物在HPLC-FLD中實現(xiàn)了基線分離，具有較強的熒光衍生峰和色譜學行為，當三種糠醛的濃度在0～4000 nM時，熒光強度與濃度有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2良好(≥ 0.9997)，檢測限較低(≤ 0.8 nM)，重現(xiàn)性好。吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)中兩個氮原子的存在，有助于衍生產(chǎn)物在質(zhì)譜分析中的離子化，并增強質(zhì)譜峰的信號強度。