MSS4在缺血再灌注損傷大鼠腎臟中的表達及作用*

譚 微，鄧軍輝，吳志芬，鄭盧權，付碧瓊，楊聚榮

(重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科 401120)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是全球的公共健康問題，每年約1 300萬人發(fā)生AKI，我國成人AKI的發(fā)病率約為11.6%，兒童20.0%，嚴重AKI患者病死率高達50%，全球每年約200萬人因AKI死亡[1-2]，如何改善AKI預后是當前全球面臨的挑戰(zhàn)。

MSS4，又名PIP5K1B，屬于磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase，PIP5K)家族成員，廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)。通過與小G蛋白結合在體內(nèi)代謝中發(fā)揮廣泛的重要作用[3-4]。既往研究報道MSS4與上皮間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相關[5-8]，EMT是AKI后腎小管上皮細胞修復和腎纖維化的重要因素，其表型及標志物的改變在AKI后早期即可檢測[9-10]。目前MSS4在AKI后的表達及作用均未知。因此，本研究擬通過大鼠缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)構建AKI模型，檢測MSS4及其相關指標的表達變化，了解MSS4在AKI腎臟中的表達變化及作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

30只無特殊病原體(SPF)級雄性SD大鼠，8周齡，體重220 g左右，購買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，環(huán)境溫度為(25±2) ℃，濕度為50%～70%，12 h光照陰暗交替。

1.1.2試劑與儀器

RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、抗體稀釋液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物有限公司；Schiff染液、蘇木素染液、DAPI購自中山金橋生物有限公司；一抗：MSS4(1∶200，SC-514169，美國Santa公司)，波形蛋白(Vimentin，1∶200，#5741，美國Cell Signaling Technology公司)，α-SMA(1∶500，#19245，美國Cell Signaling Technology公司)，β-actin(1∶5 000，AC004，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；二抗：抗鼠IgG(H+L,Alexa Fluor?594 Conjugate,1∶1 000，#8890，美國Cell Signaling Technology公司)；抗兔IgG(H+L，Alexa Fluor?488 Conjugate，1∶1 000，#4412，美國Cell Signaling Technology公司)；lipofectamin 3000(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠IRI模型構建

30只大鼠分為假手術組(5只)和IRI組(25只)。大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，IRI組做背部兩側切口，游離雙側腎蒂，使用血管夾夾閉雙側腎蒂，觀察腎臟顏色變黑后計時45 min，移去血管夾，確認腎臟顏色變鮮紅后，縫合兩側切口；假手術組大鼠做背部兩側切口，游離雙側腎蒂后縫合切口。IRI組術后0、12、24、48、72 h再次腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)大鼠眼眶采血2 mL，并打開胸腔行心臟灌注后，取腎組織標本，去除腎臟包膜，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，用于腎臟病理組織染色或免疫熒光染色，剩余部分保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測。

1.2.2細胞缺氧/復氧模型構建

采用大鼠腎小管上皮細胞NKR-52E細胞構建缺氧/復氧模型，NKR-52E細胞生長至80%，分為對照組和復氧組，對照組繼續(xù)原培養(yǎng)基培養(yǎng)，復氧組更換為無糖無血清培養(yǎng)基，于1% O2、94% N2、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)中培養(yǎng)6 h，然后更換為上述正常培養(yǎng)基，置正常培養(yǎng)箱中，分別繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48、72 h。

1.2.3腎功能檢測

采集的血液于離心機離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，采用自動分析儀(德國Beckman 5800)檢測大鼠血尿素氮、血肌酐水平。

1.2.4腎組織PAS染色

腎組織用4%多聚甲醛固定過夜，沖洗、脫水、石蠟包埋后切片，行PAS染色觀察腎臟病理損傷程度。將切片浸入高碘酸氧化液中10～20 min，蒸餾水洗2次；Schiff液染色10～30 min，流水沖洗5 min；蘇木素染細胞核3～5 min，在鹽酸乙醇中分化，自來水洗至細胞核變藍；然后脫水、透明、封固。雙盲情況下由2名腎臟病理醫(yī)師在200倍光學顯微鏡下觀察并評分，每個標本至少觀察10個不重復視野。腎小管損傷的嚴重程度由組織學評分系統(tǒng)量化：0分代表沒有損傷，1分(0%～<11%)和2分(11%～<21%)為輕度損傷，3分(21%～<41%)和4分(41%～<61%)為中度損傷，5分(61%～75%)和6分(>75%)為重度損傷。

1.2.5免疫熒光染色

大鼠腎臟組織直接OCT包埋，冰凍切片機切片6 μm，空氣干燥2 min后，-20 ℃儲存。染色前自-20 ℃取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4 ℃固定10 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入1.2%過氧化氫作用30 min，PBS清洗后加入0.3% Triton X-100作用30 min，加入稀釋至工作濃度的一抗，4 ℃過夜，次日清洗后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，清洗后DAPI 染核5 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

大鼠腎小管上皮細胞爬片后行免疫熒光染色。4%多聚甲醛(PBS配制)固定20 min，除去多聚甲醛清洗后加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min，清洗后3% H2O2孵育15 min，清洗后3% H2O2孵育15 min，清洗后10%與二抗同源的血清封閉0.5 h，滴加足夠量適宜濃度的一抗，4 ℃孵育過夜，次日清洗后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，清洗后DAPI 染核5 min，取出爬片吸干其上液體，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。使用ImageJ軟件對免疫熒光強度進行定量。各組實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測

各組大鼠腎組織經(jīng)充分碾磨后，加入含1% PMSF的RIPA(碧云天)冰上裂解40～60 min，4 ℃ 13 400 r/min離心15 min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度后，將上清液與SDS緩沖液混勻，100 ℃加熱6 min至蛋白變性。采用SDS-PAGE電泳法從每個樣品中分離出80 μg蛋白，濕轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶常溫封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗過夜。次日洗膜后加入相應的二抗，室溫避光孵育2 h。再次避光洗膜后，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey CLX，Gene Company Limited)顯影。使用ImageJ軟件對蛋白條帶的強度進行定量。各組實驗重復3次。

1.2.7轉染siRNA

NKR-52E細胞轉染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA) MSS4沉默MSS4，siRNA MSS4正向序列5′-GCU UUA CUC AAA CAG CAA ATT-3′，作為對照的NKR-52E細胞轉染siRNA negative control(NC)，siRNA NC正向序列5′-UUU GCU GUU UGA GUA AAG CTT-3′。隨后，分別將NKR-52E細胞接種貼壁，密度達到70%無血清饑餓12 h，將稀釋的siRNA和Lipo 3000試劑混合后室溫放置，形成siRNA/lipo 3000混合物，每個6孔板中加入1.9 mL無血清培養(yǎng)基及100 μL siRNA/lipofectamin 3000混合液，37 ℃溫育24 h后再缺氧6 h復氧48、72 h，免疫熒光染色以α-SMA表達水平變化來表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 IRI后腎功能及PAS染色腎損傷情況

與假手術組比較，IRI組血尿素氮、血肌酐水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，12 h最高，72 h恢復正常。腎組織PAS染色結果顯示，假手術組腎小管上皮細胞排列緊密整齊，細胞形態(tài)規(guī)則，刷狀緣完整，管腔清晰；IRI組12 h后可見腎小管上皮細胞大量壞死、脫落，基底膜裸露，至72 h仍可見少部分小管上皮細胞排列紊亂、間質(zhì)增寬。腎小管損傷評分12 h最高，72 h仍高于假手術組，見圖1。

A:血尿素氮；B:血肌酐；C:腎小管損傷評分；D:腎臟PAS染色(×200)；a：P<0.05，與假手術組比較。

2.2 IRI后腎臟中MSS4的表達變化

與假手術組比較，IRI組48、72 h的MSS4表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

A:Western blot蛋白條帶；B:MSS4灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與假手術組比較。

2.3 IRI后腎臟MSS4的定位及表達情況

腎組織免疫熒光顯示，與Vimentin定位一致，MSS4主要表達于腎小管上皮細胞，且IRI組48、72 h的MSS4及Vimentin表達水平高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

A:免疫熒光染色(×400)；B：免疫熒光強度分析；a：P<0.05，與假手術組比較。

2.4 NKR-52E細胞缺氧/復氧后MSS4、α-SMA的表達情況

細胞免疫熒光顯示，隨復氧時間的延長，復氧組MSS4、α-SMA表達水平增加，復氧組72 h明顯高于0 h(P<0.05)。對照組常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間與復氧組72 h一致，復氧組72 h MSS4、α-SMA表達仍高于對照組(P<0.05)，見圖4。

A：免疫熒光染色(×800)；B:免疫熒光強度分析；a：P<0.05，與復氧組0 h比較。

2.5 沉默MSS4對NKR-52E細胞缺氧/復氧后α-SMA表達的影響

轉染siRNA MSS4的NKR-52E細胞MSS4蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。細胞免疫熒光染色顯示，NKR-52E細胞缺氧6 h復氧48、72 h后，轉染siRNA MSS4的NKR-52E細胞α-SMA表達水平降低(P<0.05)，見圖5。

A:Western blot蛋白條帶;B:MSS4灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖;C:α-SMA免疫熒光強度分析;D:免疫熒光染色(×1 000)；a：P<0.05，與siRNA NC比較。

3 討 論

臨床上AKI的最常見病因是IRI，以雙側受累為主。動物模型中可采取單側或雙側腎動脈夾閉構建AKI模型[12]，本研究中采用夾閉雙側腎動脈45 min成功構建了IRI誘導的大鼠AKI模型，IRI組大鼠血尿素氮、血肌酐水平在術后12 h明顯升高，72 h恢復。

腎小管上皮細胞是AKI時關鍵的靶細胞，也是修復的主要參與者。AKI后腎小管上皮細胞的修復分為完全修復和不完全修復，前者腎臟功能、結構完全恢復，后者腎小管上皮細胞修復障礙，啟動纖維化[11]。EMT是指腎小管上皮細胞失去上皮細胞的表型和特性，成為間充質(zhì)細胞，從而具有強大的增殖和多向分化潛能。在完全修復中，AKI后腎小管上皮細胞首先受累發(fā)生去分化，細胞骨架的完整性和極性破壞，上皮細胞標志(E-鈣黏蛋白、急性單核細胞等)消失，出現(xiàn)Vimentin及其他間充質(zhì)細胞的表型，隨后在各種修復機制的作用下發(fā)生去分化的腎小管上皮細胞增殖、移行，并進行再分化，從而再生修復，Vimentin等隨即消失，而E-鈣黏蛋白重新表達，腎小管結構重建，腎臟功能恢復。而在不完全修復中，腎小管上皮細胞發(fā)生EMT后不能恢復上皮細胞表型，從而轉分化為肌成纖維細胞，分泌大量膠原蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質(zhì)，參與腎間質(zhì)纖維化[12-13]。既往研究表明，AKI后早期即可觀察到EMT表型及細胞形態(tài)的改變。在小鼠缺血再灌注AKI模型中，再灌注72 h上皮表型E-鈣黏蛋白表達降低，間質(zhì)細胞表型α-SMA表達明顯升高，在HK-2細胞的缺氧/復氧24 h后也觀察到α-SMA的表達上調(diào)[9]；盲腸結扎穿刺48 h及脂多糖處理HK-2細胞48 h模擬體內(nèi)外膿毒血癥AKI模型，亦觀察到α-SMA、Vimentin升高，E-鈣黏蛋白表達降低，腎小管上皮細胞出現(xiàn)分支及間隙增加、紡錘形等間質(zhì)細胞形態(tài)[10]。本研究在缺血再灌注體內(nèi)和缺氧/復氧體外模型中均觀察到AKI后72 h α-SMA、Vimentin的表達明顯升高，證實了腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生。

進一步探究MSS4的表達及其與EMT的關系，免疫熒光雙染色MSS4和Vimentin，發(fā)現(xiàn)兩者均定位于腎小管上皮細胞，表達水平具有一致性，均在AKI后72 h明顯增加。體外實驗中，缺氧/復氧后MSS4與α-SMA的表達高峰一致，利用siRNA沉默MSS4，可抑制大鼠腎小管上皮細胞表達α-SMA。證實MSS4參與調(diào)控AKI后腎小管上皮細胞EMT，但其機制尚不清楚。

MSS4是1988年在酵母中發(fā)現(xiàn)的，其與哺乳動物體內(nèi)的PIP5K同源，是具有雙重底物特異性的一種脂質(zhì)激酶，除了可將PI(4)P轉換為PI(4，5)P2、PI(3)P轉換為PI(3,4)P2以外，還為磷酸肌醇代謝與肌動蛋白細胞骨架之間提供了聯(lián)系，若MSS4缺乏，細胞在極化細胞生長過程中無法形成肌動蛋白，且無法正確定位其細胞骨架。EMT以細胞骨架的重塑為基礎，在此過程中，MSS4調(diào)控肌動蛋白絲裝配在維持細胞的形態(tài)和運動中起著重要作用。EMT發(fā)生時，一旦細胞受到上皮向間質(zhì)形態(tài)轉變信號， 接收的信息以力的形式發(fā)生傳遞，細胞內(nèi)骨架開始重新排列，細胞需要承受嚴重的變形，細胞形狀的改變導致內(nèi)部骨架網(wǎng)絡重新排列。上皮細胞的角蛋白逐漸減少直至被骨架蛋白、波形蛋白代替。在關于腫瘤細胞的研究中已明確，可通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重塑來調(diào)節(jié)EMT[5-8]。MSS4還參與凋亡的調(diào)控[15]，具有明顯的抗凋亡作用。受外界刺激后，細胞內(nèi)MSS4的表達水平迅速改變，上調(diào)的MSS4通過與真核細胞翻譯起始復合物的成員及具有明顯促凋亡特性的蛋白質(zhì)相互作用，來防止細胞程序性死亡。而對凋亡的抵抗與EMT的發(fā)生密切相關[16-17]。早期的研究還發(fā)現(xiàn)，MSS4還可以通過驅動MT1-MMP/整合素蛋白復合物的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)MT1-MMP在新形成的絲狀偽足和片狀脂質(zhì)體中的表達和激活。這促進了前MMPs向MMPs的轉化，導致ECM蛋白的裂解和重塑[18]。M1-MMP的激活進一步誘導EMT的發(fā)生[19]。但上述MSS4與EMT的相關機制均是在腫瘤細胞中研究的，在腎臟中MSS4對EMT的調(diào)控機制還需進一步驗證。

本研究尚存在一定局限性，僅證實了MSS4與EMT的相關性，未能明確其宏觀作用為促修復還是纖維化。在今后的實驗中，需構建不同損傷程度的動物模型，并延長AKI后觀察時間，以進一步明確MSS4在AKI后的作用。

綜上所述，在IRI所致大鼠AKI腎臟中，MSS4表達于腎小管上皮細胞，AKI后72 h明顯增加，參與調(diào)控腎小管上皮細胞EMT，但其調(diào)節(jié)機制及在AKI遠期進程中的作用尚待進一步研究。