水通道蛋白9在PCOS大鼠卵巢組織的表達*

潘海霞，冼佩宜，張春仁，林 菡，何曉瑩，唐慧珍，賴毛華△

(1.廣州醫科大學附屬第一醫院中西醫結合臨床婦科，廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院中醫婦科，廣州 510120)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種常見的婦科內分泌代謝紊亂性疾病，據報道，育齡婦女中PCOS的患病率為6%～10%[1]，具有高度異質性、發病多因性、表現多態性的特點。臨床主要表現為閉經、多毛、肥胖、高胰島素血癥、高雄激素血癥、不孕，超聲顯示多囊卵巢等[1]。文獻報道，75%的PCOS患者表現為無排卵性不孕[2]，卵泡發育障礙是導致PCOS不孕的主要原因。因此，探究PCOS卵泡發育障礙的機制對提高PCOS患者的生育力具有重要意義。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組存在于細胞膜上的小分子蛋白家族，可使細胞膜對水的通透性增加，對維持細胞內外的水平衡意義重大。目前在哺乳動物中鑒定出13種AQPs(AQP0～12)亞型。AQP0、1、2、4、5、6和8對水的通過具有高度的選擇性，而AQP3、7、9和10不僅運輸水，還運輸中性溶質，包括甘油、尿素和其他小的非電解質[3]。WAWRZKIEWICZ等[4]認為AQPs可能參與了PCOS的發生，其表達的變化可能影響PCOS的卵泡發育和卵泡閉鎖。QU等[5]發現PCOS患者顆粒細胞的細胞核、細胞質和細胞膜中存在 AQP9，PCOS組的AQP9表達水平明顯低于正常組，AQP9與卵泡液的雄激素水平有明顯的相關性。SONG等[6]發現PCOS患者顆粒細胞AQP9基因和蛋白表達水平較低，AQP9的表達水平與胰島素調節呈負相關，胰島素可能通過改變AQP9的表達影響PCOS卵泡的成熟。因此，推測AQP9可能參與了PCOS的卵泡發育障礙的發生，但確切的機制尚不清楚。

本研究主要通過來曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，采用免疫組織化學和Western blot觀察AQP9在卵巢組織中的定位及蛋白的表達，為進一步探討AQP9與PCOS卵泡發育的關系提供理想的動物模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雌性大鼠12只，6周齡，超級清潔(SPF)級，體重(155±10)g，購自廣東省動物實驗動物中心。自由攝取食物和水，溫度20～22 ℃，濕度60%～65%，控制12 h光照、12 h黑暗環境循環，喂食標準飼料。本研究獲得廣州醫科大學動物科學學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1PCOS模型的建立

12只SD雌性大鼠，分為正常組與模型組，每組6只。模型組參考文獻[7]的造模方法，每天予來曲唑(1 mg/kg)溶于0.5%羧甲基纖維素(CMC，2 mL/kg)灌胃，構建PCOS模型；正常組每天灌胃0.5% CMC(2 mL/kg)，連續21 d。

1.2.2標本處理

最后1次灌胃后，稱重，兩組大鼠晚8時開始禁食，次日晨8時尾靜脈采血，用葡萄糖氧化酶法測空腹血糖(羅氏血糖儀)，然后異氟烷氣體麻醉后進行心臟采血，3 000 r/min離心15 min，-80 ℃凍存用于進一步測試，最后斷頸處死大鼠，摘取雙側卵巢，去除表面脂肪組織觀察兩組大鼠卵巢大體解剖情況，稱重并記錄后，一側浸泡在4%的多聚甲醛中進行固定以便后續的組織病理分析，一側卵巢放在凍存管中，以便后續的蛋白和基因的檢測分析。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1大鼠體重、陰道涂片及卵巢質量

每天灌胃之前對大鼠進行稱重，且記錄數據。灌胃第10天開始對模型組大鼠進行陰道涂片，陰道涂片兩個動情周期(10 d)，使用瑞氏-吉薩姆進行染色，通過分析白細胞、上皮細胞和角化細胞的相對比例來監測動情周期。吸入麻醉處死大鼠后，稱重雙側卵巢，左、右卵巢的質量計算卵巢質量。

1.2.3.2性激素及糖代謝檢測

使用ELISA法進行血清中黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、雄激素、雌二醇和空腹胰島素測定，羅氏血糖儀測空腹血糖。計算LH/FSH和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=(空腹胰島素×空腹血糖)×22.5。

1.2.3.3卵巢組織學改變

在解剖鏡下剝除卵巢外周脂肪，觀察卵巢大體解剖情況。卵巢用4%多聚甲醛固定，進行常規石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察其形態學改變。

1.2.3.4免疫組織化學檢測

按照試劑說明書，石蠟包埋，蠟塊做5 μm的切片，將玻片置于60 ℃恒溫箱烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。3%過氧化氫溶液10 min滅活內源性過氧化物酶。微波修復抗原。滴加5%牛血清，38 ℃下孵育10 min，傾去勿洗。滴加一抗兔抗大鼠AQP9(美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，3次。滴加對應生物素標記的二抗，37 ℃下孵育30 min，PBS沖洗。滴加SABC，37 ℃下孵育20 min，PBS沖洗。DAB顯色：除去PBS，每張切片加新鮮配制的DAB溶液顯色，自來水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3.5Western blot

按照試劑說明書，將100 mg的卵巢組織放入0.6 mL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1,v/v)中裂解，用冰凍露卡勻漿機強力粉碎。勻漿于4 ℃、1 200 r/min離心20 min。轉移并收集上清液用于蛋白分析。每個樣品的蛋白濃度采用BCA蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。隨后，將提取的樣品煮沸10 min，-80 ℃保存待分析。負載蛋白(50 g)電泳，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.22 m,美國Pall公司)。PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，然后用不同的一抗孵育4夜，包括抗AQP9 (美國Santa Cruz公司)和抗β-actin(美國Abcam公司)。一抗一般用TBST (Tris-HCl 5 mmol/L,pH 7.6,NaCl 136 mmol/L,0.05% Tween-20) 1∶1 000稀釋。洗后TBST 3次，再與辣根過氧化物(HRP)結合二抗(1∶5 000稀釋TBST)孵育2 h，與一抗結合。Western blot采用增強化學發光法(ECL)。圖像采用Bio-Rad進行采集，Image-J軟件進行密度測定分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組體重、卵巢質量和陰道涂片比較

與正常組比較，模型組體重和卵巢質量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2。正常組具有規律的動情周期，模型組則幾乎處于以白細胞為主的動情間期，見圖3。

a：P<0.05。

a：P<0.05。

A：正常組動情期；B：正常組動情前期；C：正常組動情間期；D：正常組動情后期；E：模型組動情間期。

2.2 兩組血清性激素及糖代謝指標比較

與正常組比較，模型組LH、LH/FSH、雄激素、空腹胰島素和HOMA-IR水平升高，FSH和雌二醇水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清性激素及糖代謝指標比較

2.3 卵巢組織學改變

正常組卵巢色澤紅，表面光滑，卵巢結構清晰，可見不同發育階段的卵泡，多個黃體，顆粒細胞呈多層，形態完整，排列整齊。模型組卵巢形態蒼白，可見較多的早期發育小卵泡及閉鎖卵泡，有較多擴張的囊泡，卵泡內卵母細胞消失，卵巢顆粒細胞層數減少，卵泡膜細胞增生，黃體數量明顯下降，見圖4。

A：正常組，×20；B：正常組，×200；C：模型組，×20；D：模型組，×200。

2.4 兩組卵巢AQP9蛋白免疫組織化學染色情況

兩組卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞、黃體細胞及間質細胞均可見AQP9蛋白表達，但以顆粒細胞較明顯，主要位于細胞膜和細胞質中，呈棕黃色，模型組大鼠卵巢顆粒細胞 AQP9蛋白的表達較正常組降低，見圖5。

A：正常組，×50；B：正常組，×400；C：模型組，×50；D：模型組，×400。

2.5 兩組卵巢 AQP9 蛋白表達情況

模型組AQP9蛋白表達水平較正常組減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

a：P<0.05。

3 討 論

來曲唑是一種高選擇性非甾體類芳香化酶抑制劑，通過抑制它的底物芳香化酶阻斷雄激素向雌激素的轉換，降低雌二醇濃度，升高雄激素，導致無排卵[8]。本研究PCOS大鼠模型組特征與前期研究利用來曲唑灌胃法成功構建 PCOS 大鼠模型報道相似[7,9]。因此，本實驗采用來曲唑誘導的大鼠模型無論是內分泌、代謝紊亂方面，還是從卵巢解剖及組織學方面均與人類PCOS特征相似，是研究PCOS機制的理想動物模型。

卵泡發育歷經原始卵泡、竇前卵泡、竇卵泡，最終成為成熟卵泡這一系列過程中，卵泡液的形成及卵泡竇腔的擴大有著極其重要的地位[10]。竇卵泡主要是通過顆粒細胞上的水通道實現水的轉運，在卵泡發育過程中形成卵泡液，最終成為成熟卵泡[11]。在卵泡發育過程中，AQP9主要表達于竇狀卵泡的顆粒細胞中[11]，其參與了顆粒細胞的水轉運，可能與卵泡發育有關[12]。SALES等[13]研究認為 AQP9在卵泡的發育中起著重要的作用。RIBEIRO等[12]對小鼠進行超促排探究卵泡發育，過程中發現AQP9在卵泡快速發育階段表達明顯增加，且對AQP9進行抑制發現卵泡體積明顯變小、排卵數減少，推測AQP9在卵泡腔迅速形成過程中促進了水和其他物質的大量納入，為卵泡的進一步發育和成熟提供了環境和物質基礎。

在PCOS患者卵巢內存在大量的竇前卵泡、少數竇狀卵泡、眾多的閉鎖卵泡、濾泡囊腫和變性的囊腫。這些卵泡缺乏足夠多的成熟顆粒細胞，不能產生大量的雌激素，最終導致排卵障礙。另一方面，卵巢間質和卵泡膜組織增生持續產生雄激素[14-15]。有研究報道，PCOS患者卵巢組織AQP9 mRNA表達明顯降低[2]。AQP9的表達可能是受雄激素調控[16]。一項臨床研究發現PCOS患者顆粒細胞中AQP9表達水平降低，這一改變可能與卵泡液中高雄激素有關，雄激素可降低顆粒細胞中AQP9基因和蛋白表達[5]。另一項研究也支持這個觀點，通過在母豬的卵巢進行免疫組織化學定位發現，AQP9主要在正發育的顆粒細胞中表達，研究結果提示顆粒細胞中雄激素轉換為雌激素可能需要通過AQP9轉運的物質來實現[17]。此外，SONG等[6]發現AQP9廣泛分布在PCOS卵巢組織，PCOS壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞中均有AQP9基因及蛋白質，PCOS患者卵巢顆粒細胞AQP9的表達水平明顯下降。胰島素可能通過改變AQP9基因的表達，PCOS 卵巢局部高雄激素和高胰島素可使顆粒細胞增殖能力下降，從而導致其卵巢內形成較多的初級卵泡，引起卵泡發育障礙[18-19]。推測過高的胰島素水平和雄激素可能會損害顆粒細胞的增殖功能，導致AQP9的低表達，從而引起卵泡發育障礙，這為探討PCOS患者的發病機制提供了一個潛在的新思路和治療的新靶點。本研究表明PCOS大鼠模型卵巢AQP9主要表達在卵巢顆粒細胞，定位在細胞膜和細胞質，AQP9蛋白表達水平較正常組降低，這些特征符合PCOS患者在卵巢的表達特征。

綜上所述，來曲唑誘導的 PCOS 大鼠模型是符合 PCOS 病理生理機制的理想動物模型。本實驗通過免疫組織化學和Western blot測定了PCOS大鼠卵巢AQP9的定位和蛋白的表達特點，但AQP9影響PCOS卵泡發育及卵母細胞成熟的機制仍需進一步研究。