青蒿琥酯誘導肺腺癌細胞凋亡作用研究

尤楊 曲藝 劉亮

肺癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤，發病率及病死率較高，對人們的生命健康構成嚴重威脅[1-3]。肺腺癌是肺癌常見的病理類型，占肺癌的主要組能部分。目前，肺腺癌常規的治療方法包括手術、化學藥物治療及放射治療。早發現、早診斷、早治療可以顯著提高肺腺癌患者的生活質量及生存期。部分患者就診時已是中晚期，失去手術治療的最佳時期，化學藥物治療將成為其主要的治療方法之一。影響化療療效的主要因素包括藥物的毒副作用及腫瘤細胞對化療藥物的耐藥。因此，探尋高效低毒的抗肺腺癌藥物具有重要意義。在腫瘤治療史上，中草藥對于腫瘤的治療具有重要的意義，且具有獨特的低毒不良反應的特點[4-6]，青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，來源于植物黃花蒿。青蒿素具有特異的抗瘧作用，被廣泛應用于臨床治療瘧疾。青蒿琥酯作為青蒿素的衍生物，具有特異的抗瘧作用，且對于重型及耐藥型瘧疾治療效果甚佳[7-9]。研究發現，青蒿琥酯除具有特異的抗瘧作用外，還具有較多的其他生物活性，如抗腫瘤[10,11]，調節免疫力[12]及抗動脈粥樣硬化[13]等生物活性。目前有較多文獻報道了青蒿琥酯的抗腫瘤作用，其對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用，本研究在以往的實驗中發現，青蒿琥酯對消化道腫瘤(胃癌及食管癌等)細胞具有生長抑制作用，其作用機制與誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯有關[14,15]，但青蒿琥酯抑制肺腺癌細胞生長作用的研究筆者所見鮮有報道。本研究探討青蒿琥酯抗肺腺癌作用及其相關的作用機制，為臨床肺腺癌治療提供高效低毒的藥物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，美國Beckman Coulter公司；青蒿琥酯(60 mg，批號:LA150444)，中國桂林南藥股份有限公司；活性氧檢測試劑盒，中國碧云天生物技術公司；流式細胞儀(FC500型)，美國Beckman Coulter公司。

1.2 MTT 實驗方法檢測青蒿琥酯對肺腺癌A549細胞生長抑制率 調整肺腺癌A549細胞懸液濃度至5×104個/ml，按照每孔0.2 mlA549細胞懸液量接種于96孔細胞培養板中，代細胞貼壁后，分別加入不同濃度的Art (0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，每個藥物劑量重復3個復孔，待藥物作用24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液溫箱內繼續培養4 h后，而后棄去培養液，每孔加入180 μl DMSO，振蕩10 min。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定光密度值A490。生長抑制率 (%)=(1-用藥組A490/對照組A490)×100%。

1.3 青蒿琥酯干預肺腺癌A549細胞實驗 將處于對數生長期的肺腺癌A549細胞(濃度為1.25×106/ml)4 ml 接種于培養瓶中。待細胞貼壁后，加入不同濃度的Art，使終濃度分別達到25、50、100 μg/ml，分別命名為25、50、100 μg/ml Art組。實驗重復3次。對照組使用0.9%氯化鈉溶液代替Art。作用時間為24 h。而后收集細胞，PBS洗滌細胞2次。將細胞濃度調整為1×106/ml。

1.4 Art干預A549細胞后FCM檢測細胞凋亡率 將1.3實驗步驟中制備的單細胞懸液1 ml(含1×106個細胞)，使用PBS液洗滌1次，去上清，加入100 μl 1×binding buffer，而后加入5 μl Annexin V-FITC，避光放置15 min，加入1×binding buffer 390 μl及PI 5 μl， 避光放置15 min，使用流式細胞儀(FC500型，Beckman Coulter)檢測。

1.5 FCM檢測Art干預A549細胞后細胞內活性氧 將1.3實驗步驟中制備的單細胞懸液1 ml(含1×106個細胞)，使用PBS液洗滌1次，去除上清液，加入熒光探針10 μmol/L DCFH-DA，在37℃下避光染色20 min，PBS洗滌細胞1次后，1 ml PBS液懸浮細胞，FCM檢測。

1.6 FCM檢測Art干預A549細胞后Caspase-3蛋白 將1.3實驗步驟中制備的單細胞懸液1 ml(含1×106個細胞)使用PBS液洗滌1次，將上清液棄去，加入100 μl PBS液，加入100 μl Caspase-3抗體，避光放置30 分鐘，而后加入100 μl二抗，避光放置30 min后加入10 ml PBS液,1 000轉5 min離心，去上清，加入1 ml PBS液，FCM檢測細胞中Caspase-3蛋白表達。

2 結果

2.1 青蒿琥酯抑制肺腺癌A549細胞生長作用 不同濃度青蒿琥酯(濃度范圍0.1～800 μg/ml)作用肺腺癌A549 細胞24 h后，出現不同程度A549細胞生長抑制，青蒿琥酯對A549細胞生長抑制作用具有青蒿琥酯濃度依賴性(P<0.01)，800 μg/ml Art組與0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400 μg/ml Art組相比，A549細胞生長抑制率顯著增高(P<0.01)。青蒿琥酯作用A549細胞24 h的IC50值為(52.87±2.36)μg/ml。見表1。

表1 青蒿琥酯抑制肺癌細胞生長

2.2 青蒿琥酯誘導肺腺癌A549細胞凋亡作用 不同濃度的青蒿琥酯(濃度范圍25～100 μg/ml)作用肺腺癌A549細胞24 h后，A549細胞呈現不同程度細胞凋亡，且青蒿琥酯誘導A549細胞凋亡作用具有青蒿琥酯濃度依賴性。(25、50、100 μg/ml)青蒿琥酯組與對照組相比，細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)。100 μg/ml青蒿琥酯組A549細胞凋亡率顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組A549細胞凋亡率(P<0.01)。見表2。

表2 青蒿琥酯作用后A549細胞凋亡率

2.3 青蒿琥酯調控肺腺癌A549細胞內活性氧表達水平作用 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯作用肺腺癌A549細胞24 h，與對照組相比，細胞活性氧水平顯著增高(P<0.05)。100 μg/ml青蒿琥酯組與25及50 μg/ml青蒿琥酯組相比，A549細胞活性氧水平顯著增高(P<0.01)，青蒿琥酯可以顯著上調A549細胞內活性氧的表達水平，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。見表3。

表3 青蒿琥酯上調肺腺癌A549細胞內活性氧表達水平

2.4 青蒿琥酯調控肺腺癌A549細胞中Caspase-3蛋白表達 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯組與對照組相比，A549細胞中Caspase-3蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)，且具有青蒿琥酯濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組A549細胞中Caspase-3蛋白表達顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組細胞中的表達(P<0.05)，青蒿琥酯可以顯著上調A549細胞中Caspase-3蛋白表達水平，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。見表4。

表4 青蒿琥酯調控肺腺癌A549細胞中Caspase-3蛋白表達

3 討論

肺癌是呼吸系統常見的惡性腫瘤，發病及死亡率均居惡性腫瘤的首位[16-18]。肺腺癌是肺癌常見的病理類型。目前，肺腺癌的主要治療包括，手術、化學藥物治療及放射治療。早發現、早診斷、早治療可以顯著提高肺腺癌患者的生活質量及生存期。部分患者就診時已是中晚期，失去手術治療的最佳時期，化學藥物治療將成為其主要的治療方法之一。化療期間，藥物的毒副作用及腫瘤細胞對藥物的耐藥嚴重影響化療療效，因此，急需探尋低毒、高效的抗肺腺癌藥物。在腫瘤治療史中，中草藥治療腫瘤占據重要的地位，且中草藥具有價廉、低毒等優點。因此，從中草藥中尋找抗腫瘤藥物，具有重要意義。

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物[19-21]，青蒿素來源于植物黃花蒿。青蒿琥酯作為青蒿素的衍生物，具有特異的抗瘧作用，且對于重型及耐藥型瘧疾治療效果甚佳[22-25]。進一步的研究顯示，青蒿琥酯還具有其他生物活性，例如抗腫瘤[26]、抗炎[27]、抗病毒[28]、抗動脈粥樣硬化[13]等生物活性。文獻顯示，青蒿琥酯可以通過調控腫瘤細胞的凋亡及細胞周期，從而起到抗腫瘤作用[29]，本研究顯示，青蒿琥酯可以通過抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制食管癌及胃癌細胞生長，起到抗食管癌及胃癌作用[14,15]。Dong等[30]研究顯示，青蒿琥酯可以抑制裸鼠接種MCF-7細胞皮下移植瘤生長，其作用機制與誘導細胞G0/G1期周期阻滯及細胞凋亡有關。Holien等[31]研究顯示，青蒿琥酯在安全劑量下可以誘導淋巴瘤及骨髓瘤細胞生長停滯及細胞凋亡，沒有嚴重的毒副作用。Pang等[32]研究顯示，青蒿琥酯可以引起肝癌細胞凋亡從而起到抗肝癌的作用，其誘導肝癌細胞凋亡作用機制與調控活性氧誘導Bax依賴的內源性細胞凋亡有關。Li等[33]研究顯示，青蒿琥酯通過抑制Wnt/beta-catenin 通路的活性，從而抑制結直腸癌生長。本研究青蒿琥酯抑制肺腺癌A549細胞生長抑制作用機制，為將青蒿琥酯用于抗肺腺癌藥物提供實驗基礎。

細胞增殖與細胞凋亡的穩態對于維持機體正常組織生長具有重要意義，一但穩態失衡就會引起疾病發生，包括腫瘤的發生。Kaczanowski等[34]綜述了細胞凋亡與腫瘤的發生密切相關，細胞凋亡紊亂引起腫瘤。Tenorio等[35]研究顯示，細胞凋亡調控蛋白和細胞周期蛋白在牙源性上皮性病變中表達不同，其表達可能與成釉細胞瘤(AMB)、牙源性角化囊腫(OKC)和牙源性腺瘤樣腫瘤(AOT)的生物學行為有關。Evan等[36]綜述了細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡與癌癥的關系，顯示細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡的紊亂參與了癌癥的發生及發展。以上研究顯示，細胞凋亡與腫瘤的發生密切相關。細胞凋亡是細胞死亡的一種方式，因此，目前在尋找新的抗腫瘤藥物中，將藥物是否能夠誘導腫瘤細胞凋亡作為藥物是否具有抗腫瘤作用的觀測點之一。Wang等[37]研究顯示，敲低胰腺癌細胞中KDM1B基因表達，可以抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡，從而抑制胰腺癌的進展。Lin等[38]研究顯示，Bakuchiol可以誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯從而抑制胃癌細胞增殖，起到抗胃癌的作用。Jalali等[39]研究顯示，Kefir可以抑制人急性紅白血病細胞增殖及誘導細胞凋亡，從而有可能是治療人急性紅白血病的一種有效的方法。Ramdani等[40]研究顯示，Spiro-bisheterocycles可以抑制乳腺癌細胞增殖及誘導細胞凋亡，從而可以將Spiro-bisheterocycles開發為抗乳腺癌藥物。以上的研究均顯示了，誘導細胞凋亡可以起到抗腫瘤的作用。本研究利用MTT實驗檢測到，Art抑制A549細胞生長，且具有Art濃度依賴性。計算半數抑制濃度(IC50值)為52.87 μg/ml，因此后續實驗中選擇了25、50、100 μg/ml青蒿琥酯進行細胞干預實驗。AnnexinV/PI雙染細胞利用流式細胞術檢測細胞凋亡已是細胞凋亡檢測的金標準，文中檢測到青蒿琥酯作用A549細胞24 h后，細胞出現不同程度的細胞凋亡，青蒿琥酯濃度越大細胞凋亡率越高，此實驗結果與以往研究的青蒿琥酯誘導食管癌及胃癌細胞凋亡作用結果[14,15]一致。

活性氧(reactive oxygen species)是體內一類氧的單電子還原產物，活性氧的平衡維持機體細胞正常功能，一旦機體中活性氧增多就會導致細胞功能障礙引起疾病。過量的活性氧的主要靶細胞器為線粒體，可以誘導線粒體雙層膜通透孔開放，釋放鈣離子、細胞色素C、凋亡誘導因子AIF等引起胱冬蛋白酶Caspase-3等激活，使線粒體外膜破裂，導致細胞凋亡。Prasad 等[41]綜述了活性氧在癌癥發展的各個階段中的作用，活性氧的紊亂參與腫瘤的發生及發展，且顯示從大自然中提取的營養制劑可以通過調控活性氧從而起到抗癌作用。Moloney等[42]研究顯示，活性氧信號通路與癌癥發生及發展密切相關。本研究中檢測到青蒿琥酯作用后，A549細胞出現活性氧增多，而且具有青蒿琥酯劑量依賴性。提示，青蒿琥酯可以提高A549細胞中活性氧表達量，引起細胞凋亡。

Caspase 3是一種蛋白酶，與細胞凋亡密切相關。Caspase 3活化可以引起核酸內切酶的活化，引起細胞凋亡。Huang等[43]研究顯示，Solanum nigrum polysaccharides可以抑制肝癌細胞H22荷瘤小鼠的瘤體生長，其抑瘤作用機制與上調細胞中caspase-3表達及下調bcl-2表達有關。Yao等[44]研究顯示，Boschniakia Rossica Polysaccharide通過調控喉癌細胞Bcl-2、Caspase-3及P53表達，引起喉癌細胞凋亡，從而起到抑制喉癌細胞生長作用。Pengju等[45]研究顯示，NKX3.1通過增加Caspase-3的表達及其活性增強TNF-αlpha/CHX誘導前列腺癌細胞凋亡，從而起到抗前列腺癌作用。以上研究顯示，增加Caspase-3的表達及其活性可以導致細胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用。Art干預后，A549細胞中Caspase-3蛋白表達量增高，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。Caspase-3表達量增高可以引起不可逆性細胞凋亡。

綜上所述，青蒿琥酯對肺腺癌A549細胞具有生長抑制作用，其作用機制為青蒿琥酯上調A549細胞內活性氧及Caspase-3蛋白表達，導致A549細胞產生凋亡。我國是具有藥用效果青蒿素的主要產地，青蒿琥酯來源于青蒿素是其衍生物之一，能保證青蒿琥酯的高產量。