匹諾塞林調控miR-486-5p表達對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

張慶軍 王輝 張苗苗 毛雯 吳迪

膿毒癥是由感染引起的全身性炎性反應綜合征，若未得到有效治療，將導致膿毒癥休克和多器官功能障礙。心臟是膿毒癥最常見受累器官，有研究顯示重癥監護病房(ICU)60%以上膿毒癥患者表現為心功能障礙，其死亡率高達70%[1]。匹諾塞林(又稱為5,7-二羥基黃酮)是從蜂膠和一些植物中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、血腦屏障保護、神經保護等生物學作用[2-4]。此外，匹諾塞林還可減少缺血再灌注大鼠室性心律失常，減少心肌梗死面積，改善心臟功能[5,6]。然而關于匹諾塞林心肌保護的潛在機制并未完全闡明，匹諾塞林能否用于治療膿毒癥心肌損傷也尚未可知。微小RNA(miRNA)是一類蛋白編碼能力缺失的多功能短鏈RNA，其抑制靶mRNA的翻譯或轉錄參與廣泛的心臟病理生理和血管功能。研究顯示紫紺型心臟病患者心肌組織中miR-486-5p表達增加，抑制miR-486-5p表達可保護心肌細胞免受缺氧誘導的細胞損傷[7]。然miR-486-5p在膿毒癥心肌損傷中的作用并未報道。本研究采用脂多糖(LPS)刺激大鼠心肌細胞H9C2建立細胞損傷模型[8]，觀察匹諾塞林對LPS致心肌細胞損傷以及對miR-486-5p表達的影響，旨在揭示匹諾塞林的心肌保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠胚胎心肌細胞H9C2購自美國典型培養物保藏中心；LPS、羥丙基-β環糊精購于美國Sigma-Aldrich公司；匹諾塞林(純度大于99%)購于中國醫學科學院藥物研究院；脂質體Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；miR-486-5p抑制物(anti-miR-486-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-486-5p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miRNA反轉錄PCR試劑購于廣州銳博生物公司；丙二醛(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購于上海澤葉生物公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)凋亡檢測試劑盒購于北京寶賽生物公司；兔抗大鼠cleaved-caspase3單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH抗體單克隆購于上海碧云天生物公司；兔抗大鼠cleaved-caspase9抗體購于上海艾博抗生物公司；miRNA熒光定量PCR試劑盒購于上海生工生物工程公司。

1.2 細胞培養、轉染和分組 將匹諾塞林溶于20%羥丙基-β環糊精配置成母液，保存于-20℃冰箱。使用時用DMEM培養基將其稀釋到實驗所需濃度，其中羥丙基-β環糊精含量低于0.1%。H9C2細胞接種含有10%胎牛血清的DMEM培養基，放入37℃、含95%空氣和5%CO2、濕度97%的培養箱中培養，當細胞生長匯合度為80%時，胰酶消化按照1∶4比例傳代。

1.2.1 細胞轉染：將第5代對數期H9C2接種6孔板，每孔2×105個細胞，按照Lipofectamine 2000說明書步驟將anti-miR-NC、anti-miR-486-5p、miR-NC、miR-486-5p mimics分別轉染生長匯合度為60%細胞，培養48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.2 實驗分組：對照(Con)組：只出培養的H9C2細胞；LPS組：采用含5 mg/L LPS的培養液孵育H9C2細胞6 h[8]；LPS+匹諾塞林(PIN-)-低劑量(L)組、LPS+PIN-中劑量(M)組、LPS+PIN-高劑量(H)組：用不同劑量匹諾塞林[9](0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)預處理H9C2細胞6 h，PBS洗滌細胞3次，然后用含5 mg/L LPS的培養液繼續培養6 h；LPS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-486-5p組：用含5 mg/L LPS的培養液孵育轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-486-5p細胞6 h；LPS+PIN+miR-NC組、LPS+PIN+miR-486-5p組：用含10 μmol/L匹諾塞林的培養液預處理轉染miR-NC或轉染miR-486-5p mimics的H9C2細胞6 h，PBS洗滌后，再進行LPS處理。

1.3 試劑盒檢測H9C2細胞中MDA含量、SOD和GSH-Px活性 H9C2細胞處理完畢后，收集細胞至反應管，加入提取液超聲破碎細胞，收集上清液。參照試劑盒說明書步驟檢測H9C2細胞中MDA水平以及SOD、GSH-Px活性。

1.4 流式細胞術檢測H9C2細胞凋亡 H9C2細胞處理完畢后，重懸于500 μl 1×結合緩沖液中，隨后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，37℃暗箱孵育15 min。孵育后用流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。

1.5 蛋白質印跡法檢測H9C2細胞cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白 RIPA裂解液提取H9C2細胞總蛋白，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度。每泳道上樣30 μg蛋白經120 V的SDS-PAGE分離后，用250 mA恒流將分離蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂乳在室溫下封閉膜1 h，隨后分別加入兔抗大鼠cleaved-caspase3抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠cleaved-caspase9抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠GAPDH抗體(1∶2 000)在4℃孵育過夜。Tween-20-Tris緩沖鹽水(TBST)洗膜后，用對應的酶標二抗室溫下孵育膜1 h。最后將膜置于塑料盒，滴加化學發光試劑暗箱內顯影、定影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各條帶灰度值。

1.6 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測H9C2細胞中miR-486-5p表達量 TRIzol法提取H9C2細胞中總RNA，用miRNA反轉錄PCR試劑盒合成miR-486-5p的cDNA，再用miRNA熒光定量PCR試劑盒進行RT-qPCR反應。2-△△Ct法計算H9C2細胞中miR-486-5p表達量。引物序列如下：miR-486-5p上游5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACT GAGCTGCCC-3’，miR-486-5p下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；內參U6上游5’-CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，U6下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 結果

2.1 匹諾塞林對LPS致心肌細胞氧化應激的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細胞中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組H9C2細胞中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組3組間MDA含量、SOD和GSH-Px活性差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 匹諾塞林對LPS致心肌細胞氧化應激的影響

2.2 匹諾塞林對LPS致心肌細胞凋亡的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組H9C2細胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組3組間細胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達量差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 匹諾塞林對LPS致心肌細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 匹諾塞林對LPS致心肌細胞凋亡的影響

2.3 匹諾塞林對LPS致心肌細胞miR-486-5p表達的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細胞miR-486-5p表達量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組H9C2細胞miR-486-5p表達量顯著降低(P<0.05)。LPS+PIN-L組、LPS+PIN-M組、LPS+PIN-H組3組間miR-486-5p表達量差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 匹諾塞林對LPS致心肌細胞miR-486-5p表達的影響

2.4 干擾miR-486-5p表達對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-486-5p組H9C2細胞miR-486-5p表達量顯著降低(P<0.05)，MDA含量、細胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白的表達量顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 干擾miR-486-5p表達對LPS致心肌細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表4 干擾miR-486-5p表達對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

2.5 過表達miR-486-5p逆轉了匹諾塞林(10 μmol/L)對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的作用 與LPS+PIN+miR-NC組比較，LPS+PIN+miR-486-5p組H9C2細胞miR-486-5p表達量顯著升高(P<0.05)，MDA含量、細胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白的表達量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 miR-486-5p過表達逆轉了匹諾塞林對LPS致心肌細胞凋亡的作用；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 miR-486-5p過表達逆轉了匹諾塞林對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的作用

3 討論

匹諾塞林的抗氧化作用是其治療多種疾病的基礎。在腦缺血再灌注細胞模型中，匹諾塞林可抑制活性氧、一氧化氮和一氧化氮合酶產生，增加抗氧化酶活性，增加糖氧剝奪復氧后神經元細胞存活率，減少細胞凋亡[10]。在慶大霉素誘導的急性腎損傷中，匹諾塞林可降低氧化應激和凋亡狀態，改善腎臟功能[11]。匹諾塞林還能保護人主動脈內皮細胞免受氧化低密度脂蛋白誘導的損傷[12]。膿毒癥誘導心肌損傷后氧自由基的過量產生和抗氧化劑耗竭導致機體氧化和抗氧化的失衡，MDA是脂質過氧化終產物，其水平可反應生物體內的脂質過氧化程度，間接反應細胞損傷程度[13]。SOD和GSH-Px是重要的心肌抗氧化酶，能夠清除氧自由基，是評價自由基代謝的重要指標[14]。本研究中匹諾塞林以劑量依賴方式抑制LPS誘導的MDA水平增加和H9C2細胞凋亡，增加GSH-Px和SOD活性，降低促凋亡蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達水平。Zheng等[15]研究證實匹諾塞林通過促進糖酵解可減輕急性缺血性心肌損傷，與本研究發現的心肌保護作用一致。以上結果表明，匹諾塞林通過其抗氧化和抗凋亡特性對LPS所致心肌細胞損傷具有保護作用。

miR-486-5p是一種功能性miRNA，研究報道在LPS誘導的軟骨細胞中miR-486-5p表達增加，下調miR-486-5p明顯促進軟骨細胞增殖，減少炎性細胞因子的產生，提高抗氧化酶活性，對LPS誘導的軟骨細胞炎癥損傷、氧化應激和凋亡具有保護作用[16]。在LPS誘導的肺泡上皮細胞中miR-486-5p通過靶向去泛素化酶OTUD7B可促進炎性反應和細胞凋亡，介導急性肺損傷[17]。本研究發現LPS刺激后H9C2細胞中miR-486-5p表達明顯上調，而匹諾塞林以劑量依賴方式削弱LPS對miR-486-5p表達的促進作用，提示匹諾塞林對LPS所致心肌細胞損傷的保護作用可能是通過抑制miR-486-5p表達實現的。轉染anti-miR-486-5p進行功能分析發現，抑制表達可減弱LPS誘導的細胞凋亡，抑制cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達，降低MDA水平，并增加GSH-Px和SOD活性，與匹諾塞林的心肌保護作用相似。深入分析發現，轉染miR-486-5p mimics過表達miR-486-5p還可減弱匹諾塞林對LPS誘導的H9C2細胞凋亡、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達以及氧化應激損傷的影響，提示匹諾塞林通過下調miR-486-5p表達進而對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡具有保護作用。

綜上所述，匹諾塞林通過下調miR-486-5p表達對LPS致心肌細胞氧化應激和細胞凋亡具有保護作用，初步揭示了匹諾塞林的心肌保護作用機制，為匹諾塞林用于用于膿毒癥心肌損傷治療提供強有力的理論基礎。