lncRNA HOXC13-AS調控miR-204-5p對食管癌細胞增殖和凋亡的影響

劉聰 高麗潔 王淑芳 錢安平

食管癌是全球第八大常見惡性腫瘤類型，是癌癥相關死亡的第六大原因，世界衛生組織癌癥統計數據顯示，全球食管癌年新增病例達33萬例，死亡病例高達27萬例[1]。我國是食管癌高發國家之一，由于該病早期缺乏典型癥狀、特異性癥狀以及有效的早期診斷方法，多數患者在確診時往往處于中晚期，且綜合治療后5年存活率<30%[2]。因此，深入了解食管癌發生的分子學機制將為改善患者的生存現狀提供重要線索。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度>200 bp的非蛋白轉錄本RNA，通過表觀遺傳學修飾、轉錄調節、miRNA調控等多種方式參與包括細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成和放化療抵抗等在內的癌癥各個生物學過程[3-5]。lncRNA同源盒基因C13反義RNA(HOXC13-AS)位于12q13.13，乳腺癌、鼻咽癌中HOXC13-AS表達增加，對腫瘤發生發展起促進作用[6,7]。然而，HOXC13-AS在HOXC13-AS在食管癌中的生物學作用和潛在機制尚不清楚。本研究通過檢測食管癌組織中HOXC13-AS的水平，探討干擾HOXC13-AS表達對食管癌細胞Eca-109增殖和凋亡影響，分析其下游靶miRNA，以期為食管癌治療提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑:Eca-109細胞購自中國科學院上海細胞研究所；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購于大連寶生物公司；小干擾RNA(si-RNA)及其陰性對照(si-NC)、miRNA抑制物(anti-miR-204-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海生工公司；膜聯蛋白V(Annexin-V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、半胱氨酸蛋白酶3前體(pro-caspase3)、裂解的caspase3(Cleaved-caspase3)、羊抗兔IgG抗體購于上海艾博抗生物公司

1.1.2 組織來源:選取2017年1月至2018年1月于我院進行確診和手術切除的31例食管癌組織標本及其癌旁組織標本?；颊咝g前均未接受化療或放療，無合并其他腫瘤；其中男19例，女12例。患者均簽署知情同意書，符合醫學倫理學規定。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:Eca-109細胞采用補充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基在CO2體積分數為5%的37℃恒溫細胞培養箱中培養。細胞80%匯合時采用胰蛋白酶消化為單細胞，按照1∶3比例轉移至新的平皿中，每隔2 d換液1次。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測HOXC13-AS和miR-204-5p表達:Trizol法提取總RNA后，逆轉錄試劑盒合成cDNA利用SYBR Green PCR Master Mix進行RT-qPCR反應。GAPDH、U6分別作為檢測HOXC13-AS和miR-204-5p表達的內源性對照，2-ΔΔCT法計算HOXC13-AS和miR-204-5p相對表達量。HOXC13-AS上游引物5’-CCTCA AGAAGACCAGCCGAAGTTG-3’，下游引物5’-ATTGTTCAGAGCAAGCGGACTTCC-3’；GAPDH上游引物5’-CGAGGTCATAGTTCCTGTTGGTG-3’，下游引物CCCAATACGACCAA ATCCGTT；miR-204-5p上游引物5’-CGAAGTTCCCTTTGTCATCCT-3’，下游引物5’-GTGC AGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCG-3’。

1.2.3 細胞轉染和實驗分組:將對數期Eca-109細胞接種6孔板，按照Lipofectamine 3000說明書將si-NC、si-HOXC13-AS、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC、si-HOXC13-AS+anti-miR-204-5p分別轉染50%融合的Eca-109細胞，依次記為si-NC組、si-HOXC13-AS組、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC組、si-HOXC13-AS+ anti-miR-204-5p組。隨后將細胞用含10%胎牛血清的培養基孵育48 h，收獲細胞RT-qPCR檢測轉染效率合格后進行后續實驗。

1.2.4 集落形成實驗檢測克隆形成數:將各組細胞接種直徑60 mm培養皿中，置于培養箱中培養，當在培養皿中可見細胞集落時(約14 d)，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，4%多聚甲醛、0.1%結晶紫分別進行固定和染色。顯微鏡下計數>50個細胞的集落數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡和周期分布:①凋亡檢測：每組取1×105個細胞懸浮在500 μl結合緩沖液中，加入5 μl的Annexin-V-FITC暗室孵育15 min。隨后再加入5 μl的PI染液，暗室孵育15 min。1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡。②周期檢測：-20℃條件下用70%乙醇固定各組細胞12 h，在核糖核酸酶A存在情況下，加入PI室溫染色30 min。通過流式細胞術分析各時相細胞比例。

1.2.6 免疫印跡法(Western blot)檢測Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白表達:使用放射免疫沉淀蛋白提取試劑裂解各組細胞獲得細胞蛋白。取等量蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進行濕法轉膜。將膜置于5%脫脂牛奶緩沖液中室溫封閉1 h，然后孵育含pro-caspase3、Cleaved-caspase3抗體4℃過夜。GAPDH抗體作為對照。用山羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h后進行化學發光顯色。Image J軟件分析目的條帶灰度值。

2 結果

2.1 HOXC13-AS在食管癌組織中的表達 食管癌組織中HOXC13-AS的表達水平較癌旁組織顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 HOXC13-AS在食管癌組織中的表達

2.2 干擾HOXC13-AS對Eca-109增殖的影響 si-HOXC13-AS組Eca-109細胞克隆形成數、S期細胞比例較si-NC組顯著降低(P<0.05)，G0～G1期細胞比例較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 干擾HOXC13-AS對Eca-109的影響

2.3 干擾HOXC13-AS對Eca-109凋亡的影響 si-HOXC13-AS組Eca-109細胞HOXC13-AS表達水平較si-NC組顯著降低(P<0.05)，提示轉染si-HOXC13-AS后Eca-109細胞HOXC13-AS表達受到抑制。si-HOXC13-AS組Eca-109細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達、miR-204-5p表達較si-NC組顯著升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達較si-NC組顯著降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 干擾HOXC13-AS對Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表達的影響

圖1 干擾HOXC13-AS對Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表達的影響

2.4 HOXC13-AS靶向miR-204-5p HOXC13-AS序列中含有與miR-204-5p互補結合的位點。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-204-5p mimics和WT-HOXC13-AS共轉染后細胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-HOXC13-AS共轉染顯著降低(P<0.05)；而miR-204-5p mimics和MUT-HOXC13-AS共轉染后細胞熒光素酶活性與miR-NC和MUT-HOXC13-AS共轉染比較無顯著變化。見表4，圖2。

表4 雙熒光素酶報告實驗驗證HOXC13-AS和miR-204-5p的靶向關系

圖2 HOXC13-AS靶向miR-204-5p

2.5 干擾miR-204-5p和HOXC13-AS對Eca-109增殖凋亡的影響 si-HOXC13-AS+anti-miR-204-5p組Eca-109細胞miR-204-5p表達、細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達、G0-G1期細胞比例較si-HOXC13-AS+anti-miR-NC組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，克隆形成數、S期細胞比例、pro-caspase3蛋白表達較si-HOXC13-AS+anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)。見圖3，表5、6。

圖3 干擾miR-204-5p和HOXC13-AS對Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表達的影響

表5 干擾miR-204-5p和HOXC13-AS對Eca-109增殖的影響

表6 干擾miR-204-5p和HOXC13-AS對Eca-109凋亡的影響

3 討論

食管癌是一種常見消化道惡性腫瘤，具有發病率高、復發轉移率高等特點，是全球人類癌癥相關死亡的重要原因。目前，食管癌發生發展分子機制尚不完全清楚，本研究旨在揭示HOXC13-AS在食管癌進展中的作用。

研究顯示，肝癌組織中HOXC13-AS表達高表達，其水平升高與臨床病理分期、淋巴結轉移有關，且HOXC13-AS高表達肝癌患者的總生存期明顯縮短[8]。乳腺癌中HOXC13-AS高表達顯著促進乳腺癌細胞的增殖和腫瘤生長。膠質瘤中干擾HOXC13-AS表達顯著抑制膠質瘤細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化(EMT)過程[9]。此外，HOXC13-AS高表達在頭頸部鱗狀細胞癌中具有診斷生物標志物作用[10]。

本研究探討HOXC13-AS在食管癌發生發展中的作用發現，食管癌組織中HOXC13-AS表達較癌旁組織顯著升高。轉染si-HOXC13-AS進行體外實驗顯示，干擾HOXC13-AS表達顯著抑制食管癌細胞Eca-109克隆形成，誘導細胞周期G0-G1期阻滯和凋亡。細胞凋亡是由一系列特定的死亡誘導信號啟動，而caspase-3激活是凋亡發生的重要途徑。本研究中，干擾HOXC13-AS表達后Cleaved-caspase3蛋白水平顯著升高，pro-caspase3蛋白水平顯著降低，與干擾HOXC13-AS表達的促凋亡作用一致。以上研究證實，干擾HOXC13-AS表達在食管癌中具有抗增殖和促凋亡作用。

越來越多的研究表明，lncRNA通過與miRNA結合，從而影響和調節miRNA功能在癌癥的發生和發展中起著重要作用[11,12]。目前，關于lncRNA在食管癌進展中的作用也多與調控miRNA表達有關。例如，下調lncRNA PVT1通過促進miR-145表達，從而抑制食管癌細胞遷移和侵襲，促進細胞凋亡[13]。lncRNA CCAT1通過靶向miR-143促進食道癌細胞的增殖和順鉑耐藥[14]。

本研究通過序列分析發現，HOXC13-AS與miR-204-5p存在互不補結合位點，并通過雙熒光素酶實驗和RT-qPCR證實HOXC13-AS靶向miR-204-5p并負調控miR-204-5p表達。已有研究顯示，食管癌組織中miR-204-5p表達顯著降低，過表達miR-204-5p顯著抑制食管癌細胞增殖、遷移侵襲和EMT，并促進其凋亡[15-18]。為進一步證實HOXC13-AS是通過調控miR-204-5p表達在食管癌中發揮抗腫瘤作用，本研究將si-HOXC13-AS和anti-miR-204-5p同時轉染Eca-109細胞，結果顯示抑制miR-204-5p表達顯著降低干擾HOXC13-AS表達對Eca-109細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，降低對pro-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表達的影響，這進一步證實干擾HOXC13-AS表達至少部分通過負調控miR-204-5p來抑制Eca-109細胞增殖，誘導細胞凋亡。

綜上所述，食管癌中HOXC13-AS表達增加，干擾HOXC13-AS表達通過負調控miR-204-5p能夠抑制食管癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，是食管癌的潛在治療靶點。