瑞舒伐他汀抑制miR-122-5p減輕LPS誘導的神經細胞損傷

羅凱 段華彬 羅明鼎 宋世杰 舒宇輝

脊髓損傷是造成癱瘓和感覺障礙的主要原因，不僅給患者帶來嚴重的身體及心理創傷，還給患者家庭造成極大的經濟負擔。研究顯示，神經細胞過度的氧化應激和炎性反應、神經遞質蓄積、神經軸突損失、神經細胞凋亡等均可引起脊髓損傷[1]。因此，尋找能夠改善神經損傷的的藥物對預防和治療脊髓損傷十分必要。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是臨床常用的調節血脂的藥物，具有較好的降脂效果。研究顯示，瑞舒伐他汀可能通過抑制Sphk1-S1P信號傳導通路介導的的炎性因子表達來減輕ox-LDL誘導的內皮細胞損傷，延緩動脈粥樣硬化進程[2]；瑞舒伐他汀可抑制氧糖剝奪/復氧誘導的腦微血管內皮細胞凋亡，減輕細胞損傷，具有維持血腦屏障的潛在價值[3]。但目前，瑞舒伐他汀對神經細胞損傷的影響尚筆者未見報道。miR-122-5p是一種微小RNA(miRNA)，參與調控細胞凋亡、炎性反應和氧化應激等生理或病理過程，在多種疾病發生發展中起重要作用[4,5]。有報道，miR-122-5p在乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷中表達升高，靶向下調其表達可減輕小鼠肝損傷[6]。miR-122-5p對神經細胞損傷的影響也還未知。因此，本研究以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12為研究對象，采用脂多糖(LPS)誘導PC-12細胞建立神經細胞損傷模型，觀察瑞舒伐他汀對神經細胞損傷的影響及其能否調控miR-122-5p發揮作用，以期為神經損傷性疾病的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC-12，上海通派生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；DMEM培養基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；LPS，美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-122-5p模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-122-5p抑制劑(anti-miR-122-5p)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspases-3)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體，美國Santa Cruz公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染:復蘇PC-12細胞，用含10% FBS的DMEM培養基培養。當細胞生長密度至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。將對數生長期的PC-12細胞以5.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂質體法，分別轉染miR-NC、miR-122-5p mimics。轉染6 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理:未轉染的PC-12細胞分為對照組(NC組)、LPS組、0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組和1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組，其中NC組細胞常規培養基培養，LPS組細胞用含1.0 mg/ml[7]LPS的培養基培養，0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組和1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組細胞分別用含0.01、0.1、1.0 μmol/L[8]的瑞舒伐他汀與1.0 mg/ml LPS共同培養。轉染miR-NC、miR-122-5p mimics的細胞均用含1.0 μmol/L的瑞舒伐他汀與1.0 mg/ml LPS共同培養，分別記為miR-NC+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、miR-122-5p+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖:將未轉染、轉染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細胞均以1.0×104個/孔接種于96孔板中，5組中每組設3個復孔。培養24 h后，加10 μl CCK-8試劑。再孵育1.5 h后，酶標儀450 nm檢測吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將未轉染、轉染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設3個復孔。培養24 h后，收集細胞，PBS清洗2次，并調整細胞濃度為2.5×104個/ml。取1.0 ml細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加500 μl結合緩沖液，重懸細胞。加10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min 后，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot法檢測Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達:將未轉染、轉染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設3個復孔。培養24 h后，收集細胞，PBS清洗2次。RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，以每孔20 μg蛋白行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉移至PVDF膜，并于5 %脫脂奶粉中封閉1 h。然后分別于Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、IL-1β(1∶500)、IL-6(1∶500)、TNF-α(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液中4℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中37℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-122-5p表達:將未轉染、轉染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設3個復孔。培養24 h后，收集細胞，PBS清洗2次。Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：miR-122-5p上游5’-GGAGAGAGCCCGGCGAGC-3’，下游5’-ACGAACTCTCGCGCCGG-3’；內參U6上游5’-CCCGAAGATAGCGCGGAG-3’，下游5’-CGATAGAGCGAGAGGG-3’。2-△△Ct法計算miR-122-5p相對于內參U6的表達水平。

2 結果

2.1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞活力的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細胞A值降低(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細胞A值升高(P<0.05)。見表1。

表1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞活力的影響

2.2 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞凋亡的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細胞凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細胞凋亡率降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞凋亡的影響

圖1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞凋亡的影響；A Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達；B 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.3 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞炎性因子表達的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 Western blot檢測IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的相對表達

表3 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞炎性因子表達的影響

2.4 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞中miR-122-5p表達的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細胞中miR-122-5p表達水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細胞中miR-122-5p表達水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 瑞舒伐他汀對miR-122-5p表達的影響

2.5 上調miR-122-5p逆轉瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞活性、凋亡及炎性因子表達的影響 與miR-NC+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組比較，miR-122-5p+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細胞中miR-122-5p水平升高(P<0.05)，細胞A值降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)，IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 上調miR-122-5p逆轉瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細胞活性、凋亡和炎性因子表達的影響

圖3 Western blot檢測Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表達

3 討論

脊髓損傷包括初次打擊和二次損傷，其中二次損傷主要為神經細胞損傷，預防和減輕神經損傷對改善脊髓損傷患者預后具有重要意義[9]。PC-12細胞是從大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤克隆而來的細胞系，在細胞生長因子的誘導下可分化為神經樣細胞，且具有良好的神經細胞特性，常被用作探究神經系統疾病的模型細胞[10]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，能夠誘導細胞產生過度的炎性反應，嚴重時可引起細胞凋亡，是細胞損傷的常用誘導劑[11]。本研究顯示，PC-12細胞經LPS誘導后，其活性降低，而凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達水平明顯升高，與相關報道結果[7]一致，說明LPS誘導的PC-12細胞損傷模型建立成功。

瑞舒伐他汀是一種他汀類藥物，主要用于治療高膽固醇血癥，也可用來預防心血管疾病。研究顯示，瑞舒伐他汀可能通過抑制TLR4/NFκBp65信號通路減少LPS誘導人外周血晚期內皮祖細胞ROS的生成和氧化損傷[12]。瑞舒伐他汀抑制柯薩奇B3病毒誘導的小鼠心肌細胞凋亡和炎性反應，改善心臟功能，對小鼠病毒性心肌炎具有保護作用[13]。本研究顯示，一定劑量(0.01、0.1、1.0 μmol/L)的瑞舒伐他汀可有效提高LPS誘導的PC-12細胞活性，并減少其凋亡。細胞凋亡是一種神經細胞損傷的表現形式，其受多種基因分子的調控。Caspases級聯反應參與細胞凋亡，caspases-3是該級聯效應的關鍵調控分子，其在受到上游凋亡刺激信號后活化形成Cleaved-caspases-3，進而介導蛋白剪切，引起染色質固縮，導致細胞凋亡[14]。本研究顯示，瑞舒伐他汀可降低LPS誘導的PC-12細胞中Cleaved-caspases-3蛋白的表達，亦表明其抑制了LPS誘導的PC-12細胞損傷，減輕了細胞損傷。

脊髓損傷過程中伴有大量促炎因子的生成和釋放，這些炎性因子可加重脊髓損傷。IL-1β可介導中性粒細胞浸潤，加重損傷區域的炎性反應[15]。IL-6是機體應對感染和組織損傷產生的重要介質，參與炎性反應[16]。TNF-α是巨噬細胞分泌的具有多種生物學效應的細胞因子，可激活炎癥細胞參與炎性反應，介導免疫應答[17]。研究表明，脊髓損傷后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達明顯增加[18]。本研究顯示，瑞舒伐他汀降低了LPS誘導的PC-12細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達，說明瑞舒伐他汀可減弱LPS誘導的神經細胞炎性反應，減輕神經細胞炎性損傷。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調節神經細胞凋亡、炎性反應和氧化應激等生命活動，與神經損傷性疾病的發生發展密切相關。miR-122-5p作為一種miRNA，參與多種疾病的發展進程。研究顯示，慢性乙型肝炎肝損傷患者血清中miR-122-5p表達升高，其診斷慢性乙型肝炎肝損傷的敏感度為83.3%，特異性為73.3%，可作為診斷慢性乙型肝炎患者肝損傷生物標志物[19]；miR-122-5p拮抗劑可抑制脂多糖誘導小鼠肺微血管內皮細胞炎癥、凋亡和氧化應激，miR-122-5p通可能是急性肺損傷的潛在治療靶點[20]。本研究顯示，LPS誘導PC-12細胞后細胞中miR-122-5p表達水平升高，提示miR-122-5p可能參與LPS誘導的PC-12細胞損傷；而瑞舒伐他汀抑制了LPS誘導的PC-12細胞中miR-122-5p的表達，且上調miR-122-5p表達逆轉了瑞舒伐他汀對LPS誘導的PC-12細胞凋亡及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達的抑制作用，提示瑞舒伐他汀可能通過下調miR-122-5p表達來抑制LPS誘導的PC-12細胞損傷。

綜上所述，瑞舒伐他汀可提高LPS誘導的PC-12細胞增殖活性，抑制細胞凋亡及炎性因子的表達，其作用機制可能與下調細胞中miR-122-5p的表達有關，具有減輕神經細胞損傷、治療脊髓損傷的潛在作用。