氧化苦參堿聯合紫杉醇對人胃癌細胞HGC-27和裸鼠移植瘤模型的抑制作用

黃義新 劉煒

胃癌(gastric cancer)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率極高。因胃癌預后差，發病率不斷上升，已成為世界性的重大健康問題[1]。盡管外科手術是治療胃癌的關鍵方式，但化療和放化療對于改善可切除惡性腫瘤的預后是必不可少的[2]。目前，化療已成為治療中晚期胃癌的主要手段之一。作為一種標準的抗癌藥物，紫杉醇(paclitaxel，PTX)在許多腫瘤的治療中發揮著重要的作用。研究表明，單一抗癌藥物紫杉醇治療中晚期胃癌的有效率為11%～23%，而聯合用藥的有效率為50%～60%[3]。目前，中藥聯合化療藥的治療模式已廣泛應用于惡性腫瘤的治療，且取得可觀的療效[4]。氧化苦參堿(Oxymatrine，Oxy)是從豆科植物苦參中分離出來的一種生物堿，主要成分是氧化苦參堿，也含有少量的氧化槐果堿，具有清熱解毒、利尿、抑制病毒和抗腫瘤等多種功效。近年來，氧化苦參堿已用于腫瘤化療引起的白細胞減少癥的治療，已成為腫瘤化療研究的新熱點[5,6]。然而，Oxy與PTX聯合應用對人胃癌的協同抗腫瘤作用尚不清楚。因此，本研究探討Oxy聯合PTX對人胃癌HGC-27細胞和裸鼠移植瘤的抑制作用，以提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 氧化苦參堿注射液購自四川科倫藥業股份有限公司；紫杉醇注射液購自海南卓泰制藥有限公司；0.9%氯化鈉溶液購自武漢普諾賽生命科技；RPMI-1640培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；MTT檢測試劑和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；除抗體外Western blot檢測所需相關試劑均購自上海碧云天生物技術研究所；PCNA和Cleaved Caspase-3單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司。

1.2 細胞株與實驗動物 (1)人胃癌HGC-27細胞株購自中國科學院細胞庫，HGC-27細胞復蘇后置于RPMI-1640培養液中，并加入體積分數為10%的FBS，放置在37℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養，待細胞生長至單層貼壁后，使用0.25%的胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，取對數增殖期的HGC-27細胞進行試驗。(2)28只健康清潔級BALB/c裸鼠，4周齡，雌性，體重(20.0±2.0)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；實驗裸鼠常規分籠飼養，自由飲水攝食，飼養環境溫度調整為20～25℃，相對濕度在40%～70%，本實驗獲得動物倫理委員會的批準。

1.3 HGC-27細胞分組處理 用胰蛋白酶消化對數期的HGC-27細胞，調整細胞密度并接種到96孔板中，每孔接種2×104個細胞，放置在37℃培養箱培養12 h，待細胞貼壁后分為4組：對照組(不處理)、氧化苦參堿組(氧化苦參堿2 mg/ml)、紫杉醇組(紫杉醇10 μmol/ml)和氧化苦參堿聯合紫杉醇組(氧化苦參堿2 mg/ml+紫杉醇10 μmol/ml)，4組細胞加入相應藥物處理24 h或48 h，收集細胞進行相關指標檢測。本研究加藥濃度參考預實驗結果。

1.4 MTT法檢測細胞存活率 4組HGC-27細胞藥物處理24、48 h后，吸去舊培養液，每孔細胞中加入100 μl MTT試劑(終濃度為5 mg/ml)，放回37℃培養箱培養4 h，取出細胞，除去細胞上清液，再向每孔細胞中添加150 μl DMSO，振蕩溶解沉淀，以只添加培養液不加細胞的孔為空白調零孔，使用酶標儀測定570 nm處各孔細胞的光密度(OD)值，計算4組HGC-27細胞存活率，細胞存活率(%)=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 HGC-27細胞分組處理48 h后，除去上清液，收集4組HGC-27細胞，用PBS緩沖液重懸細胞，制成濃度1×106個/ml的細胞懸液，向細胞懸液中添加Annexin V-FITC 5 μl，避光孵育5 min，后加入PI染液5 μl，混勻后，室溫下避光孵育15 min，1 h內用流式細胞儀檢測4組HGC-27細胞凋亡情況，用ModFit LT軟件分析細胞凋亡率。

1.6 Western blot實驗檢測PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白表達 HGC-27細胞分組處理48 h后，加入適量裂解液，在冰上裂解30 min，將裂解液轉移至離心管中，離心，上清即所需蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量測定，蛋白樣品與緩沖液混合后于沸水中加熱致蛋白變性，取40 μg蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后采用濕轉法轉移至PVDF膜上，隨后將膜放置在含10%脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，取出膜并洗滌3次，加入相應稀釋的單抗，PCNA和Cleaved Caspase-3單抗均為1∶800稀釋，放置在4℃條件下雜交，次日取出膜并洗滌3次，加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，取出膜并洗滌3次，采用ECL化學發光液進行顯影，在凝膠成像系統中采集圖像，以GAPDH為內參，分析各條帶灰度值。計算HGC-27細胞中PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白相對表達水平。

1.7 動物模型與分組 人胃癌HGC-27細胞與基底膜基質按照體積比1∶1的比例進行混勻，調整細胞濃度為5×107個/ml，放置在冰盒中備用，BALB/c裸鼠采用3%～4%異氟醚進行麻醉，每只裸鼠右前腋皮下接種約1×107個細胞，接種7 d后，當移植瘤平均體積約144 mm3時(參考文獻[7]的方法判斷構建模型是否成功)，將28只荷瘤裸鼠隨機分為4組(每組7只)：對照組(Mock組：0.9%氯化鈉溶液)、氧化苦參堿組(Oxy組：氧化苦參堿75 mg/kg)、紫杉醇組(PTX組：紫杉醇10 mg/kg)和氧化苦參堿聯合紫杉醇組(Oxy+PTX組：氧化苦參堿75 mg/kg+紫杉醇10 mg/kg)，4組每天通過腹腔注射給藥，持續給藥28 d，觀察并記錄裸鼠狀態。

1.8 動物模型與分組相對移植瘤體積、體質量和抑瘤率 每周測量2次裸鼠腫瘤體積(游標卡尺測定裸鼠移植瘤的長徑和短徑)，在28 d時采用頸椎脫臼法處死裸鼠，完整分離移植瘤，稱重，測量腫瘤體積，計算抑瘤率。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2；抑瘤率=(1-給藥組平均移植瘤體積/對照組平均移植瘤體積)/×100%=(1-給藥組平均移植瘤體重/對照組平均移植瘤體重)/×100%。

2 結果

2.1 HGC-27細胞存活率變化 MTT檢測結果顯示，藥物處理24 h時，與對照組相比，氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的存活率明顯降低(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的存活率明顯降低(P<0.05)；與對照組相比，氧化苦參堿組和紫杉醇組細胞存活率有不同程度的降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。藥物處理48 h時，與對照組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的存活率明顯降低(P<0.05)，與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的存活率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組HGC-27細胞存活率比較

2.2 HGC-27細胞凋亡率變化 流式細胞術結果顯示，與對照組相比，氧化苦參堿組、紫杉醇組和氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 流式細胞術檢測HGC-27細胞凋亡情況

表2 4組HGC-27細胞凋亡率比較

2.3 HGC-27細胞中PCNA和Cleaved Caspase-3表達的變化 Western blot結果顯示，與對照組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞中PCNA的表達水平明顯降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3的表達水平明顯升高(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯合紫杉醇組HGC-27細胞中PCNA的表達水平明顯降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3的表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖2,表3。

表3 4組HGC-27細胞中PCNA和Cleaved Caspase-3水平比較

圖2 Western blot檢測4組HGC-27細胞中PCNA和Cleaved Caspase-3的表達

2.4 裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較 與Mock組相比，Oxy組、PTX組和Oxy+PTX組移植瘤體積均明顯降低(P<0.05)；與Oxy組和PTX組相比，Oxy+PTX組腫瘤體積明顯降低(P<0.05)，抑瘤率明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較

2.5 裸鼠移植瘤重量和抑瘤率比較 與Mock組相比，Oxy組、PTX組和Oxy+PTX組移植瘤腫瘤均明顯降低(P<0.05)；與Oxy組和PTX組相比，Oxy+PTX組腫瘤重量明顯降低(P<0.05)，抑瘤率明顯增加(P<0.05)。見表5。

表5 裸鼠移植瘤重量和抑瘤率比較

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率高，早期診斷率低。胃癌的預后與治療時間密切相關，早期內鏡下可行根治性切除，5年生存率>90%[8]。但我國絕大多數患者診斷為晚期或有遠處轉移，對這些患者來說，全身治療(以化療為主)仍是晚期胃癌患者的最佳選擇，但胃癌化療的發展已進入瓶頸階段，生存期的提高較為有限[9]。PTX是治療胃癌的重要藥物，能有效延長晚期胃癌患者的生存時間，提高患者的生活質量。然而，近年來的大量臨床和實驗研究發現，某些類型的惡性腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胃癌，會對PTX產生主要或次要的抵抗作用[10-13]。此外，高劑量的PTX不僅能夠殺傷腫瘤細胞，同時對正常細胞也存在殺傷作用，對機體產生較大的毒副作用。因此，探討一種提高PTX抗癌作用的新方法具有重要意義。

以往大量研究顯示，藥物輔助治療在癌癥治療中取得較大進展，已成為多數研究者關注的熱點[14,15]。Li等[16]研究顯示，黃芩素聯合吉西他濱能夠有效抑制胰腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡，且在胰腺癌CFPAC-1細胞移植小鼠模型中，黃芩素和吉西他濱聯合治療可顯著降低腫瘤重量和體積，抑制腫瘤生長。苗金鈺等[17]研究發現，姜黃素和雷公藤紅素聯合使用可有效抑制胃癌的發展。王康等[18]實驗顯示，二氫楊梅素和依托泊苷聯合使用可明顯增強抑制絨毛膜癌JAR細胞生長的作用，并且聯合用藥能夠減少化療藥依托泊苷的用量。眾所周知，腫瘤的發生是由于細胞增殖和凋亡之間的不平衡。PCNA是一種在細胞周期的G1期和S期后期合成的核蛋白，用于監測細胞生長狀態的變化[19]。PCNA表達的調控是細胞增殖早期變化的一個重要指標，為Oxy和PTX抑制細胞增殖提供了可能的機制。本研究結果表明，Oxy和PTX通過抑制PCNA在胃癌細胞中的表達來抑制細胞增殖。以前的研究表明，凋亡受Caspase家族調控，活化的Caspase-3能夠誘導染色體分裂和細胞凋亡[20]。在本研究中，觀察到Oxy和PTX均能夠促進Cleaved Caspase-3的表達，而兩種藥物聯合使用后效果更顯著。提示Oxy和PTX聯合誘導胃癌細胞凋亡可能與上調Cleaved Caspase-3表達有關。目前的研究結果表明，Oxy和PTX聯合應用比單獨使用兩種藥物更有效地抑制胃癌細胞的生長。此外，本研究通過裸鼠移植瘤體內實驗驗證了該結論，Oxy和PTX單獨或聯合使用均能夠降低移植瘤的重量和體積，且聯合用藥效果更優。

綜上所述，Oxy和PTX聯合給藥在抑制增殖抑制和誘導凋亡方面比單一藥物更有效。初步證明Oxy與PTX具有協同抗癌作用。因此，為達到同樣的抑制作用，Oxy可以減少PTX的劑量，增強胃癌細胞對PTX的敏感性，減弱大劑量化療藥物對機體多系統的毒副作用。本實驗結果可為臨床應用單味中藥Oxy和化療藥物PTX治療胃癌提供理論和實驗依據。