肺炎鏈球菌的不同形態觀察及臨床藥敏分析

麥婉湘，文宏宇，黃亞薇

廣西壯族自治區桂林市中醫醫院檢驗科，廣西桂林 541002

肺炎鏈球菌可作為定植菌定植于鼻咽部,也可引起感染,人類是其唯一宿主,通過人的飛沫和呼吸道分泌物傳播,可引起敗血癥、腦膜炎、肺炎、中耳炎等。據世界衛生組織報道，肺炎鏈球菌每年大約造成160萬人死亡，以發展中國家占多數，2018年的研究數據顯示，全球因為感染肺炎鏈球菌而死亡的<5歲的兒童有29.4萬名[1]，且中國兒童肺炎鏈球菌感染呈增加趨勢[2]。抗菌藥物仍是治療肺炎鏈球菌感染的主要手段，青霉素為肺炎鏈球菌經驗治療的首選藥物，但隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎鏈球菌的耐藥率不斷上升，加強對抗菌藥物耐藥率的監測，及時發現耐藥率的改變,熟悉本地區該菌的藥敏特點對臨床診療和合理應用抗菌藥物有重大意義。本文從臨床病例分離出的肺炎鏈球菌的菌落形態特點、臨床分布、耐藥率等方面進行回顧性分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2019-2020年本院住院及門診病例的臨床標本(包括痰液、血液、肺泡灌洗液、膿液、分泌物等)進行常規分離培養，剔除同一患者同一部位重復分離株，共93株肺炎鏈球菌納入分析。

1.2儀器與試劑 血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程有限公司)，奧普托欣(Optochin)藥敏紙片(溫州市康泰生物科技有限公司)，10%去氧膽酸鈉溶液(杭州天和微生物試劑有限公司)，DL-96STREP試劑板(珠海迪爾生物工程有限公司)，肺炎鏈球菌質控菌株ATCC49619(國家臨床檢驗中心)。

1.3方法 各類標本嚴格按臨床檢驗操作規程進行常規分離培養，其中，痰液標本需直接涂片進行質量評估，白細胞>25個/每低倍視野、鱗狀上皮細胞<10個/每低倍視野為合格痰液，直接涂片鏡下呈革蘭陽性球菌，矛頭狀相對，與白細胞伴行、聚集或者被白細胞吞噬的標本需作為有效信息記錄下來，接種培養后，選擇可疑菌落(痰液標本需結合涂片信息情況)做Optochin試驗、膽汁溶菌試驗和珠海迪爾生物工程有限公司DL-96STREP試劑板的鑒定和藥敏試驗，Optochin試驗敏感、膽汁溶菌試驗陽性且DL-96STREP試劑板鑒定為肺炎鏈球菌的菌株共計93株，藥敏結果判定使用美國臨床和實驗室標準協會CLSI2019標準。

1.4統計學處理 采用WHOET5.6軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數或百分率表示。

2 結 果

2.1性別年齡分布 男性多于女性，男性58例(62.4%)，女性35例(37.6%)；以老年人和兒童為主，老年人和兒童總體占89.2%，60歲以上老人20例(21.5%)，14歲以下兒童63例(67.7%)，其中4歲以下的嬰幼兒53例，占同期兒童病例的84.1%。

2.2標本類型分布 93株肺炎鏈球菌中，痰液占93.5%，血液占3.2%，肺泡灌洗液、耳分泌物、膿液各占1.1%，見表1。

2.3形態觀察 93株肺炎鏈球菌中，非黏液型菌落89株，占95.7%，黏液型菌落4株，占4.3%，均分離自兒童痰液標本。分離出該菌的痰液標本原始涂片鏡下可見肺炎鏈球菌呈現矛頭狀，有莢膜，引起感染狀態下與白細胞呈現吞噬或伴行的相關性。在血平板上，有兩種不同的菌落形態，常見形態為非黏液型，呈中央凹陷似“臍窩”狀，草綠色溶血，邊緣整齊；黏液型不常見，仍有草綠色溶血，呈水狀，圓形或邊緣融合。兩種形態菌落Optochin試驗均為敏感，見圖1。

表1 93株肺炎鏈球菌的標本類型分布

注：A為非黏液型菌落，呈中央凹陷狀；B為非黏液型菌落Optochin試驗敏感；C為黏液型菌落；D為黏液型菌落Optochin試驗敏感。

2.4菌株科室分布 93株肺炎鏈球菌中，以兒科(65.6%)和心肺病科(9.7%)為主，急診科占5.4%，康復醫學科、腦病科、脾胃病科各占3.2%，腎病科、重癥醫學科、門診各占2.2%，內分泌科、創傷科、外科各占1.1%，見表2。

表2 93株肺炎鏈球菌的臨床科室分布

2.5藥敏試驗結果 93株肺炎鏈球菌中，對紅霉素的耐藥率為95.7%，四環素的耐藥率為93.3%，克林霉素的耐藥率為90.3%，頭孢呋辛的耐藥率為77.4%，復方磺胺甲噁唑的耐藥率為60.2%，頭孢曲松的耐藥率為9.7%，利福平的耐藥率為6.7%，美羅培南的耐藥率為4.3%，阿莫西林/克拉維酸的耐藥率為3.2%，左氧氟沙星的耐藥率為2.2%，青霉素的耐藥率為1.1%，利奈唑胺、萬古霉素無耐藥數據，見表3。4株黏液型肺炎鏈球菌對頭孢曲松、利福平、美羅培南、阿莫西林/克拉維酸、左氧氟沙星、青霉素、利奈唑胺、萬古霉素均敏感，對紅霉素、克林霉素、四環素均耐藥，頭孢呋辛耐藥1株、中介2株、敏感1株，復方磺胺甲噁唑中介1株、敏感3株,見表4。

表3 93株肺炎鏈球菌(非腦脊液)的藥敏試驗結果分析(%)

表4 4株黏液型菌株藥敏試驗結果(%)

3 討 論

肺炎鏈球菌為咽喉部的定植菌，在機體低免疫狀態下可致病，常引起呼吸道感染，也可引起侵襲性感染，是全球<5歲兒童和>65歲老年人的常見感染菌,也是導致上述人群死亡的重要原因,是一個嚴重的公共衛生問題[2]。本研究中老年人和兒童病例總體占比為89.2%，可見兒童可能存在的未健全免疫系統、不良營養狀況，老年人基礎疾病狀態及組織器官功能的退化等是該菌致病的主要條件。痰液是該菌檢出的主要標本類型，但在臨床標本檢驗流程中，應對痰液標本進行質量評估，嚴格檢驗流程，結合臨床，對該菌的定植或致病狀態做出正確判斷。

肺炎鏈球菌引起的感染從臨床表現上無法確定感染源，診治水平與實驗檢測水平在不同地區、醫院差異較大[3]，在培養鑒定過程中，檢驗人員必須對該菌的菌落特點和鑒定流程有充分的認識和鑒別能力，才能準確快速分離出該菌。本研究分離的兩種菌落形態中，非黏液型常見，呈中央凹陷似“臍窩”狀，邊緣整齊，黏液型菌落較少見，仍有草綠色溶血，但表面呈水狀，圓形或連接成片，容易被誤認為是銅綠假單胞菌等其他黏液型菌落，需加強對黏液型肺炎鏈球菌的認識和警覺，還需結合直接涂片中鏡下是否有符合革蘭陽性、成雙、矛頭狀等特點的菌體，以及是否與白細胞呈相關性等進行綜合分析，才能避免誤檢、漏檢。黏液型菌落有厚莢膜并產生大量透明酸莢膜多糖，其致病性很強，93株肺炎鏈球菌中，黏液型4株均分離自兒童痰液標本，與國內報道均分離自成人不同，在同期兒童標本61例中占6.6%，高于文獻報道[4-5]，黏液型肺炎鏈球菌在兒童病患中的分離率值得關注。

本研究藥敏試驗結果顯示，肺炎鏈球菌對紅霉素的耐藥率最高，達95.7%，肺炎鏈球菌對大環內酯類抗菌藥物的耐藥機制主要為靶位的改變，即核糖體50s亞單位改變，由ersB基因介導[6]。歐美國家的數據表明，肺炎鏈球菌對紅霉素的耐藥率達50%以上[7]，在我國該類耐藥情況更為嚴重，應避免經驗用藥。對克林霉素、四環素也同樣呈高耐藥狀態，耐藥率>90%，復方磺胺甲噁唑耐藥率>60%，與耐藥監測網統計數據相近[8]。而本研究中肺炎鏈球菌對頭孢呋辛的耐藥率高于全國耐藥監測網和國內其他報道[9-12]，可能與菌株的地區流行及本地區用藥習慣有關。對利福平、頭孢曲松的耐藥率<10%，阿莫西林/克拉維酸、左氧氟沙星、美羅培南的耐藥率均<5%，與國內研究一致[13]，有較高的敏感率，可根據藥敏試驗結果及臨床患者情況選擇及調整抗菌藥物的使用。肺炎鏈球菌對青霉素耐藥率較低，為1.1%，可作為肺炎鏈球菌感染治療的首選藥物，但國內有較高耐藥率的報道[14]，耐青霉素肺炎鏈球菌的機制是6種青霉素結合蛋白(pbp)發生改變，使得與青霉素的結合力下降，耐藥率升高的情況與抗菌藥物的過度使用有關[15]，應持續關注耐青霉素肺炎鏈球菌的耐藥率并加強耐藥監測。利奈唑胺、萬古霉素敏感率較高，耐藥菌株尚未檢出，在臨床上可用于治療重癥感染患者。

黏液型肺炎鏈球菌的耐藥分析報道較少，因為莢膜較厚，有較強的致病性，不容易產生耐藥性[4-5]。本研究中的4株分離自兒童病例的黏液型肺炎鏈球菌藥敏結果顯示：對頭孢曲松、利福平、美羅培南、阿莫西林/克拉維酸、左氧氟沙星、青霉素、利奈唑胺、萬古霉素均敏感，但對紅霉素、克林霉素、四環素均耐藥，與本地區肺炎鏈球菌對該3類抗菌藥物高度耐藥相近，復方磺胺甲噁唑敏感3株、中介1株，頭孢呋辛耐藥1株、中介2株、敏感1株，其耐藥的情況高于國內其他文獻報道[4、5]，盡管樣本量小，但黏液型肺炎鏈球菌的耐藥率值得關注和探討。

綜上所述，檢驗人員必須對肺炎鏈球菌的形態，特別是對非常規的形態和特征提高認識，規范鑒定流程，才能提高檢出率，及時準確找出感染源，避免誤檢漏檢。本研究的藥敏試驗結果顯示，肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環素有較高的耐藥率，應避免經驗用藥，對青霉素、阿莫西林/克拉維酸、左氧氟沙星、美羅培南有較高的敏感率，建議根據具體藥敏結果調整使用，利奈唑胺、萬古霉素耐藥菌株未發現，可用于重癥感染的治療。肺炎鏈球菌耐藥率在不同地區有差異，跟本地區的流行情況、醫院類型、用藥習慣等有關，臨床應對本地區肺炎鏈球菌的藥敏情況有更多的了解和分析，積極檢測病原菌，及時做藥敏試驗，加強耐藥監測，才能為肺炎鏈球菌引起的各類感染性疾病提供更精準的抗感染治療，遏制耐藥趨勢和高耐藥水平菌株的出現。本研究中4株黏液型肺炎鏈球菌均分離自兒童病例，對部分抗菌藥物的耐藥情況比國內其他報道的耐藥率高，其在兒童病患中的分離率及耐藥率值得關注和探討。近年來的研究顯示，肺炎鏈球菌可以在毒力因子作用下存活于細胞內，抗感染更為艱巨和嚴峻[16]，疫苗接種是預防肺炎鏈球菌感染的有效手段。