基于化學修飾法制備油溶性梔子藍色素及其性能表征研究

郝旭，郜亞昆，劉國榮*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京工商大學，北京 100048；2.天津市和平區市場監督管理局，天津 300041)

梔子藍色素是GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》準許使用的天然色素之一，通過梔子果實內部的京尼平苷經β-葡萄糖苷酶水解反應后得到京尼平，進而再和伯胺化合物進行一系列的聚合和重排反應制得，其具備耐酸、耐堿和耐高溫的特性，可以廣泛用于食品、藥品及化妝品領域[1]。梔子藍色素所含有的京尼平有很好的保健功效，具備一定抑菌活性的同時具有抑制腫瘤生長、疏通血管和調節血糖的生理活性，受到食品和醫學保健領域的廣泛關注，在食品加工領域可以保證安全性的前提下，有效改善食品的色澤[2]。其主要通過與黃色素如梔子黃色素復配出不同色調的綠色，還可以與紅色素如甜菜紅色素和玫瑰茄紅色素復配出不同色調的紫色進而用于硬糖、餅干、蛋糕和蔬菜類罐頭食品的著色，特別被用作天然無毒的調味品添加于飲料、果汁、布丁和冰淇淋等食品中[3]。因其著色效果出色，受到食品加工行業和消費大眾的青睞。

梔子藍色素極性強，易溶于水，顏色呈現亮藍色，染色性能好。但其不溶于油脂及其在光照下易發生褪色的缺點，直接影響產品在生產、儲存及銷售過程中的感官品質，限制了梔子藍色素的廣泛應用[4]。

對于色素本身已經具有的官能團，可運用化學修飾法通過化學反應來增添相應的化學基因，起到改變色素自身性質的作用，進而使得色素的溶解性發生變化，改善其穩定性[5]。茹先古麗·買買提依明等[6]和張兆英等[7]分別通過研究西紅花色素和火龍果果皮紅色素發現在強光和高溫環境下色素極易分解，而盧佳云等[8]制備得到的川陜金蓮花黃色素卻具備較好的耐熱性，說明色素的耐熱性和耐光照性等受到色素分子結構的影響。Cruz等[9]通過運用原花青素和硬脂酰氯在一定條件下可發生的酯化反應，在進行純化操作后獲得親脂性酰基化原花青素，并具有較高的得率。硬脂酰氯含有的酰氯基團可以發生酯化反應，通過改性引入長碳鏈來修飾其分子結構以改變其親水特性，目前硬脂酰氯已經作為良好的改性材料用于茶多酚、蓮原花青素和核桃青皮多酚等物質的化學改性。利用化學改性法可以在梔子藍色素中引入相關疏水性基團，并封閉部分親水性基團，使得分子極性顯著減低，從而將色素的溶解范圍進一步擴大。

在本試驗研究中，油溶性梔子藍色素的制備采用了硬脂酰氯酯化法，利用單因素逐級試驗優化工藝條件，基于紫外-可見光譜、掃描電鏡及傅里葉紅外光譜對其進行定性表征；通過分析梔子藍色素衍生物的溶解性及其在不同溫度和光照條件下所具有的穩定性能，對化學修飾法在關于調整改善梔子藍色素穩定性及溶解性兩方面的應用可行性進行科學評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水溶性梔子藍色素：江蘇遷潤生物技術有限公司；硬脂酰氯(純度≥97%)：上海麥克林生化科技有限公司；乙腈(色譜純)：賽默飛世爾科技有限公司；硅膠板GF254(50 mm×100 mm)、玻璃層析缸、硅膠(200～300目)：青島海洋化工廠；60～90 ℃沸程石油醚：北京化工廠；氫氧化鈉、乙醇、二氯甲烷、三乙胺、乙酸乙酯等其他試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

BSA2245型分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SHZ-A水浴恒溫振蕩器、離心機 上海博迅實業有限公司；UV-3600 plus型紫外可見光分光光度計 日本島津公司；CM-3600A分光測色計 柯尼卡美能達投資有限公司；IKA RV10旋轉蒸發儀、恒溫加熱磁力攪拌器 德國IKA公司；玻璃層析柱(26 mm×300 mm) 北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油溶性梔子藍色素的制備及純化

采用酯化法制備油溶性梔子藍色素：先使用分析天平精確稱取一定質量的水溶性梔子藍色素，將其放入三頸瓶中，然后加入一定體積的二氯甲烷使其充分溶解。在0 ℃下按一定比例分別向三頸瓶中加入硬脂酰氯和三乙胺，置于帶有磁力攪拌器的恒溫加熱器中，并在一定溫度下加熱回流一定時間，反應結束后冷卻至室溫。采用石油醚對上述步驟制得的梔子藍色素衍生物萃取3次，每次置于4 ℃冰箱中萃取0.5 h，4 ℃下12000 r/min離心15 min，將3次提取液合并；將萃取后的梔子藍色素衍生物加入層析柱中，以V正己烷∶V乙酸乙酯為1∶2為洗脫劑進行洗脫除去雜質，最后將色素洗脫出來，旋蒸除去正己烷及乙酸乙酯，然后將其放置在40 ℃的烘箱中進行烘干，直至恒重，從而得到純化后的油溶性梔子藍色素。

1.3.2 油溶性梔子藍色素制備工藝條件優化

在制備梔子藍色素衍生物的過程中，主要有三方面因素：反應物的比例和反應的溫度條件以及反應時間。將獲得的梔子藍色素衍生物的產量以及其具備的色價作為考察指標進一步展開單因素逐級試驗，以此來對影響色素衍生物形成的主導因素進行確定。

1.3.2.1 不同反應物比例對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

在分析天平上量取40 mg(0.1 mmol)的水溶性梔子藍色素，將其溶于3 mL二氯甲烷，加入三頸瓶中，在0 ℃下按1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6、1∶7∶7(n水溶性梔子藍色素∶n硬脂酰氯∶n三乙胺)的摩爾比例分別加入硬脂酰氯和三乙胺置于30 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中，并加熱回流24 h，反應結束后冷卻至室溫，純化并進行干燥，測定所得色素的產量和色價。

1.3.2.2 不同反應溫度對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

稱取40 mg (0.1 mmol)的水溶性梔子藍色素，將其溶于3 mL二氯甲烷，加入三頸瓶中，在0 ℃下按1∶5∶5(n水溶性梔子藍色素∶n硬脂酰氯∶n三乙胺)的摩爾比加入硬脂酰氯和三乙胺，分別置于30，40，50，60 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中，并加熱回流24 h，反應結束后冷卻至室溫，純化并進行干燥，測定所得色素的產量和色價。

1.3.2.3 不同反應時間對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

在分析天平上量取40 mg(0.1 mmol)的水溶性梔子藍色素，將其溶于3 mL二氯甲烷中，加入三頸瓶中，在0 ℃下按1∶5∶5(n水溶性梔子藍色素∶n硬脂酰氯∶n三乙胺)的摩爾比加入硬脂酰氯和三乙胺，置于40 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中，并加熱回流18，24，30，36，42 h，反應結束后冷卻至室溫，純化、干燥，測定所得色素的產量和色價。

1.3.3 最大吸收波長的測定

使用分析天平分別稱取油溶性梔子藍色素和水溶性梔子藍色素各100 mg，將這兩種色素分別溶解在石油醚和超純水中，并進行適當倍數的稀釋，將石油醚和超純水作為參比物，運用紫外-可見分光光度計對色素溶液在400～700 nm區間內的可見吸收光譜進行測定，進而明確油溶性梔子藍色素所具有最大吸收波長。

1.3.4 色素的色價測定

先取出油溶性梔子藍色素粉末及水溶性梔子藍色素，分別在分析天平上稱取一定質量的粉末物，將油溶性梔子藍色素在石油醚中溶解，而水溶性梔子藍色素在超純水中溶解，并稀釋至適當倍數，用容量瓶定容后，采用色差儀測定其色度，以1 cm 玻璃比色皿分別在超純水和石油醚做參照下，采用紫外分光光度計在最大吸收波長處下測定其吸光值，色價參考陳思佳[10]的方法進行測定，代入下式進行計算：

1.3.5 色素的色值、色差及色素殘留率的測定

色素的色值(CIELAB 體系)，即L*、a*、b*值使用色差計進行測定，經不同處理后的色差值計算公式如下[11-12]：

明度差：ΔL*=LS*-LT*。

紅/綠差：Δa*=aS*-aT*。

黃/藍差：Δb*=bS*-bT*。

式中：下標S代表處理后樣品，下標T代表處理前樣品。

在λmax下測定梔子藍色素及其衍生物的吸光值A[13]，根據公式計算色素殘留率：

式中：A后表示試驗完成后，在λmax處油溶性梔子藍色素具有的吸光值；A前表示試驗開始前，該色素在最大吸收波長處所測得的吸光值。

1.3.6 微觀形態(SEM)

將干燥后的水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素粉末經點樣、噴金后，采用Hitachi S-3400N型掃描電子顯微鏡觀察兩種梔子藍色素微粒間的微觀結構差異。

1.3.7 傅里葉紅外光譜檢測(FTIR)

分別稱取3 mg水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素色素粉末，與300 mg溴化鉀粉末充分混合研磨至100目，取少量混合物進行壓片。采用DTGS檢測器，光譜范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描時扣除水和空氣的干擾。

1.3.8 梔子藍色素衍生物的溶解性

先稱取質量相同的油溶性梔子藍色素和水溶性梔子藍色素，然后量取體積相同的不同溶劑，觀察上述兩種色素在溶劑中的溶解性。

1.3.9 梔子藍色素衍生物的穩定性

1.3.9.1 光照穩定性

將水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素粉末分別溶于超純水和石油醚中，分別在590 nm和 624 nm處將吸光值調整為0.80，然后分別將其放置在下面4種光照條件下7 d：(1)陽光照射強度(40000 lux)；(2)燈光直射強度(13000 lux)；(3)室內散射強度(300 lux)；(4)陰暗避光條件(對照)。待試驗結束后分別對溶液取樣，進行色調以及吸光值的測量，根據測量結果進行色素色差以及殘留率的計算。

1.3.9.2 溫度穩定性

將水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素粉末分別溶于超純水和石油醚中，分別在590 nm和 624 nm處調吸光值A=0.80，分別在4，25(室溫)，40，60，80，100，120 ℃ 7個條件下避光放置24 h，然后取樣并對色素溶液進行色素色調以及吸光值的測定，根據測量結果對色素色差和殘留率展開計算。

1.3.10 數據處理與分析

每一個試驗需重復進行3次，然后選用SPSS 25軟件展開相應的數據分析。

2 結果與分析

2.1 梔子藍色素衍生物制備工藝條件優化

2.1.1 反應物比例對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

由圖1可知，在水溶性梔子藍色素添加量為40 mg，反應物比例(水溶性梔子藍色素∶硬脂酰氯∶三乙胺)為1∶5∶5(摩爾比)時，油溶性梔子藍色素的產量最高，為(308±8.6)mg，色價最高，為23.9±0.9。之后，隨反應物比例的增加，梔子藍色素衍生物的產量不再增加，色價也隨之降低，說明此時水溶性梔子藍色素與硬脂酰氯和三乙胺已基本反應完全，反應物的最佳比例為水溶性梔子藍色素∶硬脂酰氯∶三乙胺 1∶5∶5(摩爾比)。

圖1 不同反應物比例對梔子藍色素衍生物產量(a)和色價(b)的影響Fig.1 Effect of molar ratios of reactants on yield (a) and color value (b) of gardenia blue pigment derivatives

2.1.2 反應溫度對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

由圖2 可知，反應溫度在30 ℃時，水溶性梔子藍色素添加量為40 mg可制備得到的油溶性梔子藍色素的產量最高，為(422±7.4) mg，但產物色價僅為7.3±0.2；而在反應溫度為40 ℃時，制備得到的油溶性梔子藍色素的質量為(309±6.8) mg，色價最高，為23.9±0.6，隨著反應溫度的增加，梔子藍色素衍生物的產量開始下降，色價也降低明顯，推測可能是由于反應溫度較高造成色素分解，因此梔子藍衍生物制備的最佳反應溫度為40 ℃。

圖2 不同反應溫度對梔子藍色素衍生物產量(a)和色價(b)的影響Fig.2 Effect of reaction temperatures on yield (a) and color value (b) of gardenia blue pigment derivatives

2.1.3 反應時間對油溶性梔子藍色素產量和色價的影響

由圖3可知，當反應時間達到30 h時，經反應得到的油溶性梔子藍色素產量為(402±7.1) mg，且隨著反應時間的增加，衍生物產量不再增加；而衍生物色價在反應時間為30 h時最高，為26.3±0.7，隨著反應時間的增加，色素的色價不再升高反而開始下降，表明此時的水溶性梔子藍色素和硬脂酰氯兩者基本上已經反應完全，同時色素沒有出現分解的情況。因此，30 h是該化學反應的最佳反應時間。

圖3 不同反應時間對梔子藍色素衍生物產量(a)和色價(b)的影響Fig.3 Effect of reaction time on yield (a) and color value (b) of gardenia blue pigment derivatives

2.1.4 驗證試驗

由上述單因素試驗得到制備油溶性梔子藍色素的優化后工藝條件：反應物摩爾比例n水溶性梔子藍色素∶n硬脂酰氯∶n三乙胺為1∶5∶5，反應溫度為40 ℃，反應時間為30 h。在上述反應條件下展開相應的驗證試驗，最終得到油溶性梔子藍色素的質量為(402±8.2) mg，色價為 26.3±0.6，油溶性梔子藍色素呈現深藍綠色粉末，溶液為藍綠色。

2.2 油溶性梔子藍色素的紫外-可見吸收光譜圖

兩種梔子藍色素的紫外-可見吸收光譜圖見圖4。

圖4 水溶性和油溶性梔子藍色素的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-vis spectra of water-soluble and oil-soluble gardenia blue pigments

由圖4可知，水溶性梔子藍色素的最大吸收波長(λmax)為590 nm，油溶性梔子藍色素的λmax為624 nm。肉眼所見藍色及藍綠色物質所具有的紫外-可見吸收波長區間范圍是640～580 nm，由此可見，上述兩種色素都是藍色素，由于油溶性梔子藍色素的化學改性使其化學結構出現了變化，所以改性后的色素衍生物所具有的最大吸收峰出現了紅移(即最大吸收峰向長波長方向移動)。

2.3 微觀形貌分析(SEM)

采用掃描電子顯微鏡可以觀察色素樣品微粒的微觀結構。水溶性梔子藍色素(a)及油溶性梔子藍色素(b)在放大20000倍下的掃描電鏡圖見圖5。

圖5 兩種梔子藍色素的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope images of two gardenia blue pigments

由圖5可知，兩種色素的立體形態截然不同，水溶性梔子藍色素為不規則狀，而油溶性梔子藍色素則為片狀結構，說明通過化學改性使得梔子藍色素衍生物的化學結構發生了變化，進而影響其結構形態產生了改變。

2.4 FTIR分析

對水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素進行紅外光譜檢測，結果見圖6。

圖6 水溶性梔子藍色素(a)和油溶性梔子藍色素(b)的紅外光譜圖Fig.6 FT-NIR spectra of water-soluble gardenia blue pigment(a) and oil-soluble gardenia blue pigment (b)

2.5 溶解性分析

水溶性梔子藍色素和油溶性梔子藍色素在不同溶劑中的溶解性見表1。

表1 兩種梔子藍色素在不同溶劑中的溶解性Table 1 The solubility of two gardenia blue pigments in different solvents

由表1可知，經化學改性后，油溶性梔子藍色素可溶于乙酸乙酯和食用油等弱極性的脂溶性溶劑，表明通過化學改性一定程度上封閉了梔子藍色素的親水性基團，使得通過硬脂酰氯酯化法制得的油溶性梔子藍色素具有較好的脂溶性。梔子藍色素衍生物溶解性與紅外光譜結果相印證，這是由于通過硬脂酰氯酯化改變了梔子藍色素的分子結構，在梔子藍色素分子中引入了酯基并且增加了疏水性烷基，降低了梔子藍色素衍生物與油脂間的極性差異[15]，從而提高了兩種物質間的互溶程度。

2.6 穩定性分析

2.6.1 光照穩定性

水溶性梔子藍色素及油溶性梔子藍色素放置在下面4種光照條件下：(1)陽光照射強度(40000 lux)；(2)燈光直射強度(13000 lux)；(3)室內散射強度(300 lux)；(4)陰暗避光(對照)，得到的光照穩定性繪制結果見圖7。

圖7 兩種梔子藍色色素在不同光照條件下的穩定性Fig.7 The stability of two gardenia blue pigments under different light conditions

由圖7可知，在陽光照射強度、燈光直射強度、室內散射光強度、陰暗避光條件下處理7 d后的油溶性梔子藍色素穩定性顯著低于水溶性梔子藍色素；油溶性梔子藍色素對光最不穩定，在陽光照射和燈光直射7 d時色素殘留率僅為21.2%和22.5%，而在室內散射和陰暗避光的條件下殘留率則為79.8%和88.6%。張芳等[16]研究了憎水性梔子藍色素的穩定性，結果表明，在陰暗避光條件下梔子藍色素衍生物的穩定性較好，靜置28 d之后色素殘留率維持在52.8%；周慶新等[17]對梔子紅色素的光穩定性進行了測定，發現經強光照射處理后，其吸光值顯著下降，而在室內自然光、紫外燈照射和避光條件下，其吸光度無明顯變化。此外，色差分析結果(見表2)與色素殘留率結果基本保持一致，在4種光照條件下，兩種色素的亮度差、綠值差、藍值差、總色差均有明顯差異(P<0.05)，油溶性梔子藍色素在4種光照條件處理7 d后的亮度、綠值、藍值均變化明顯，總色差較大。陳峰等[18]也發現室外自然光對梔子藍色素具有一定的影響，避光條件下穩定性良好，梔子藍色素殘留率可維持在較高水平。因此，通過化學修飾法得到的油溶性梔子藍色素在室內散射光和陰暗避光條件下的穩定性明顯好于陽光照射和燈光直射條件下的穩定性。

表2 兩種梔子藍色素在不同光照條件下的色差變化Table 2 The color differences of two gardenia blue pigments under different light conditions

2.6.2 溫度穩定性

水溶梔子藍色素和油溶性梔子藍色素分別在4，40，60，80，100，120，25 ℃(室溫對照)溫度條件下的穩定性結果見圖8。

圖8 兩種梔子藍色素在不同溫度條件下的穩定性Fig.8 The thermal stability of two gardenia blue pigments at different temperatures

由圖8可知，油溶性梔子藍色素在80～120 ℃條件下，保溫24 h后的殘留率明顯低于水溶性梔子藍色素(P<0.05)，而4～60 ℃保溫24 h后的殘留率略低于水溶性梔子藍色素(P>0.05)。油溶性梔子藍色素穩定性在4，25，40，60 ℃條件下色素殘留率分別為91.8%、90.2%、94.5%和79.6%。劉蘭香等[19]研究了油溶性胭脂紅酸衍生物的穩定性，制備所得的5種油溶性胭脂紅酸衍生物的光及熱穩定性良好，Cu2+、Fe3+和Al3+可使色素產物發生褪色，本研究制備的油溶性梔子藍色素則在較高溫度下穩定性變差。此外，色差分析結果(見表3)與色素殘留率結果基本一致，在4～60 ℃條件下，油溶性梔子藍色素與水溶性梔子藍色素的亮度差、藍值差和總色差有明顯差異(P<0.05)。油溶性梔子藍色素穩定性的研究結果與羅義發等[20]發現的低于室溫的條件下放置對梔子藍色素穩定性影響較低的結論相一致。因此，油溶性梔子藍色素在4，25，40 ℃等較低溫條件下的穩定性較好，環境溫度越高，制備所得的油溶性梔子藍色素的穩定性均隨之降低。

表3 兩種梔子藍色素在不同溫度下的色差Table 3 The color differences of two gardenia blue pigments at different temperatures

3 結論

在接下來的研究中，試驗應深入探索梔子藍色素與硬脂酰氯酯化反應的動力學特性、可能出現的副產物及油溶性梔子藍的化學結構，從而更好地理解油溶性梔子藍色素的形成過程，并為減少副產物生成、提高色素的穩定性提供理論依據。