響應(yīng)面優(yōu)化離子液體超聲輔助提取黃花菜總黃酮工藝研究

張臘臘，胡浩斌，韓明虎，楊會玲

(隴東學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 慶陽 745000)

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)是百合科萱草屬草本植物的花[1-2]，屬于典型的藥食同源食療食品。黃花菜含有豐富的營養(yǎng)[3]及藥用價(jià)值[4-5]，研究表明黃花菜具有消腫、止血、抗菌、抗抑郁等功效，黃花菜中的黃酮是其抗抑郁的主要活性成分[6]，而且黃酮還是食品、調(diào)味品的生產(chǎn)原料[7-8]，所以從黃花菜中提取黃酮一直是研究熱點(diǎn)。黃花菜中黃酮提取的傳統(tǒng)方法有乙醇浸提法、超聲輔助提取法、乙醇回流法、微波提取法等[9-10]。

傳統(tǒng)提取方法普遍存在溶劑用量大、提取時(shí)間長、提取效率較低的問題。離子液體作為一種綠色環(huán)保型溶劑，因?yàn)槠渥陨淼奶攸c(diǎn)在提取天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)方面已經(jīng)有很廣泛的應(yīng)用[11-13]。在黃酮類化合物提取中已經(jīng)有離子液體在紅花[14]、銀杏[15]、葛根[16]、香葉總黃酮[17]等提取中的報(bào)道。采用離子液體從黃花菜中提取黃花菜黃酮尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。研究擬采用離子液體作為提取溶劑提取黃花菜中總黃酮，用響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期解決傳統(tǒng)方法中有機(jī)溶劑用量過大及提取效率過低的問題，為黃花菜高附加值的生產(chǎn)提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃花菜：摘自甘肅慶陽慶城縣；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)：購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、離子液體[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl(均為分析純)：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

7230G型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)有限責(zé)任公司；SHB-3A型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝科技有限責(zé)任公司；YP20002型電子天平 上海橫際科學(xué)儀器有限公司；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁對照品10 mg，加入75%乙醇使其完全溶解，定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL于5支25 mL容量瓶中，加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，立即搖勻，靜置6 min；加入1 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻；6 min后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，搖勻，再放置等待6 min；最后用75%的乙醇溶液定容至25 mL，搖勻放置20 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白組，使用分光光度計(jì)在波長為510 nm處測定不同濃度下的吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]，進(jìn)行線性回歸所得回歸方程為Y=1.0086X-0.0024(R2=0.9996)，說明黃花菜總黃酮含量與吸光度值在0～0.3 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 黃酮的提取及提取率的計(jì)算

黃花菜蒸熟曬干后用植物粉碎機(jī)粉碎待用。按照試驗(yàn)所需料液比加入不同體積、不同濃度的離子液體水溶液，在試驗(yàn)溫度下超聲提取一定時(shí)間后過濾，所得濾液中上清液作為黃花菜總黃酮提取液。吸取總黃酮提取液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定其在510 nm波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取液中黃酮濃度C，并由下式計(jì)算出總黃酮得率:

式中：w為樣品液中黃酮的濃度(mg/mL)；C為樣品吸光度；V0為取樣體積(mL)；V1為稀釋體積(mL)；V2為樣品溶液體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黃花菜烘干粉碎過70目篩，分別稱取1.0 g黃花菜粉末平行5組，考察離子液體種類([C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl)、離子液體濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、提取時(shí)間(15，30，45，60，75 min)對總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 8.0.6 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，以離子液體濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)為因素，以黃花菜總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體種類的選擇

由圖1可知，隨著碳鏈長度的增加，黃花菜總黃酮得率增大，但是溴鹽要比氯鹽得率高，這是因?yàn)锽r-能與黃酮之間形成較強(qiáng)π-π相互作用和氫鍵相互作用，有利于黃酮的提取；碳原子數(shù)超過6以后，溴鹽和氯鹽黃酮的產(chǎn)率均開始下降，因?yàn)殡S著碳原子數(shù)的增多，導(dǎo)致空間位阻增大，增加了總黃酮的溶出阻力，因此確定[C6mim]Br作為提取溶劑。

圖1 離子液體種類影響結(jié)果Fig.1 The effect of types of ionic liquids on the extraction rate of total flavonoids

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 離子液體濃度對總黃酮提取的影響

由圖2可知，黃花菜總黃酮提取率隨著[C6mim]Br濃度的升加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這是因?yàn)殡x子液體濃度升高，其黏度會隨之增大，提取溶劑的黏度太大會阻礙總黃酮的溶出，而且溶劑滲透進(jìn)黃花菜的能力也會下降，所以確定[C6mim]的濃度為0.8 mol/L。

圖2 離子液體濃度影響結(jié)果Fig.2 The effect of content of ionic liquid on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 料液比對總黃酮提取的影響

由圖3可知，在料液比為1∶15之前，隨著料液比的增大，黃花菜總黃酮提取率增大，料液比在1∶15時(shí)達(dá)到最大，隨后開始降低。因?yàn)榱弦罕容^低時(shí)，溶劑量較少，總黃酮和提取溶劑濃度差較大，增大了總黃酮溶出的勢差，利于黃酮的提取，隨著料液比的繼續(xù)增加，溶劑的滲透壓增大，會導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出，黃酮的提取率下降，所以選擇料液比為1∶15(g/mL)。

圖3 料液比影響結(jié)果Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 提取溫度對總黃酮提取的影響

由圖4可知，黃花菜總黃酮提取率在提取溫度為70 ℃ 時(shí)達(dá)到最大值，溫度低于或超過70 ℃，總黃酮得率都呈現(xiàn)下降趨勢。呈現(xiàn)這種趨勢是因?yàn)樵跍囟刃∮?0 ℃時(shí)，升高溫度和超聲波起到了協(xié)同加和的效果，所以總黃酮提取率隨著溫度的升高而增大，溫度超過70 ℃后，總黃酮的結(jié)構(gòu)可能由于高溫受到損壞，導(dǎo)致提取率開始下降，確定試驗(yàn)溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度影響結(jié)果Fig.4 The effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取時(shí)間對總黃酮提取的影響

提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5可知，30 min之前黃酮提取率隨著時(shí)間的延伸增加比較緩慢，30 min后提取率增加比較顯著，45 min時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，之后又開始下降。這是因?yàn)殡x子液體提取黃酮的原理是它可以與植物細(xì)胞壁中的纖維素形成氫鍵，破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，將黃酮大量溶出。剛開始提取由于時(shí)間太短，離子液體沒有充分滲透進(jìn)黃花菜組織，所以總黃酮溶出量較低，而隨著時(shí)間的延伸，黃花菜中總黃酮基本上完全被提取，時(shí)間繼續(xù)延長，離子液體可能會與其他物質(zhì)的纖維素作用，導(dǎo)致非黃酮類物質(zhì)溶出，總黃酮的得率下降。因此最終確定試驗(yàn)時(shí)間為45 min。

圖5 提取時(shí)間影響結(jié)果Fig.5 The effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)分析結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experiment results of RSM

2.3.2 響應(yīng)面模型與分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，可以得到以下數(shù)學(xué)模型：

R1=14.93+1.67A-1.30B+0.78C+3.58D-0.33AB+1.94AC+1.98AD-0.42BC+2.08BD-1.03CD-5.32A2+1.81B2+0.92C2+0.7D2。

各因素的方差分析結(jié)果見表3。

表3 離子液體提取黃花菜總黃酮回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis for the regression model of ionic liquid extraction of total flavonoids from Hemerocallis citrina

續(xù) 表

由表3可知，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀癙>F”值小于0.01，二次方程擬合極顯著，說明本次試驗(yàn)方法可靠，可以用來分析和預(yù)測離子液體對黃花菜總黃酮提取的效果。一次項(xiàng)中提取溫度的“P>F”值小于0.01，因此它對提取率的影響極顯著，離子液體濃度的“P>F”值小于0.05，說明離子液體濃度對黃花菜總黃酮提取率的影響顯著，而B和C的“P>F”值均大于0.05，說明料液比和浸提時(shí)間對黃花菜總黃酮提取率的影響不顯著；二次項(xiàng)中A2的P>F”值小于0.01，B2的“P>F”值小于0.05，C2、D2的“P>F”值均大于0.05，所以二次項(xiàng)對總黃酮提取率的影響大小依次為A2>B2>C2>D2。

由圖6可知，各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果為：離子液體濃度與料液比的交互作用等高線呈橢圓形，當(dāng)料液比較小時(shí)，離子液體濃度對黃花菜總黃酮提取率的影響顯著，表現(xiàn)在圖上為曲線較陡，說明在料液比較小的范圍內(nèi)增加離子液體濃度，總黃酮提取率有明顯的升高；當(dāng)料液比增大時(shí)，曲線開始變得平緩，說明料液比較大時(shí)增加離子液體濃度，總黃酮提取率不再顯著升高，說明這兩個因素之間是互相制約的關(guān)系，這也符合二次回歸方程中這兩項(xiàng)系數(shù)為負(fù)的結(jié)果。

圖6 因素交互作用響應(yīng)面結(jié)果圖Fig.6 The response surface plots and contour lines of interaction of various factors on the extraction rate of total flavonoids

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由回歸模型預(yù)測得到[C6mim]Br提取黃花菜總黃酮的最佳條件：[C6mim]Br濃度為0.83 mol/L，料液比為1∶20(g/mL)，提取時(shí)間為30.02 min，提取溫度為60.35 ℃，總黃酮提取率預(yù)測值為23.47%。為方便實(shí)際試驗(yàn)操作，修正條件為：離子液體濃度0.8 mol/L、料液比1∶20(g/mL)、提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃。 在此條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)值為23.30%，與預(yù)測值相對誤差為0.72%，說明此方法所得工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

采用[C6mim]Br提取黃花菜總黃酮的最佳工藝條件為：[C6mim]Br水溶液濃度0.8 mol/L，料液比1∶20(g/mL)，提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃，在此條件下黃花菜總黃酮提取率為23.30%，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取工藝(提取率0.581%[18])相比，黃花菜總黃酮提取率有了大幅提高。上述試驗(yàn)結(jié)論為黃花菜黃酮在食品、藥品、功能型調(diào)味品方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，可以提高黃花菜的附加價(jià)值。