市售調味醬中5種真菌毒素的測定

蔣孟圓，陳俊秀，農蕊瑜，申穎，李潔，胡琳，李文廷*

(1.云南民族大學 民族醫藥學院，昆明 650500；2.昆明市疾病預防控制中心，昆明 650228)

芝麻醬和花生醬具有豐富的植物蛋白、維生素和礦物質,是大眾消費者普遍喜愛的香味調味品[1-2]。出于消費者口味的考量，商家會加入風味獨特如板栗等上乘的食材，也有商家為了博取豐厚的利潤而添加大豆、玉米等廉價原材料[3-5]，另外不同的加工方式對芝麻醬和花生醬的粒徑和穩定性均有不同影響，在儲存過程中，容易出現析油分層現象，對品質保障具有一定的影響[6]。然而，由于原材料或者添加的輔料本身在種植、儲藏、轉運過程中以及成品在儲存售賣期間均可能受到霉菌的污染，給商家造成經濟損失，給消費者的健康和食品安全形成嚴重威脅[7]。

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是在濕熱條件下主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)產生的次生代謝產物，主要有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFTB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFTB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFTG1)和黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFTG2)，其中AFTB1的毒性最強，污染程度也最嚴重，黃曲霉毒素的毒性作用主要表現為嚴重破壞人及牲畜的肝臟組織，導致肝癌或死亡[8-10]。近乎50%的霉菌品種如赭曲霉菌、黑曲霉菌、青霉屬等都能產生赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA的危害主要表現為腎臟及肝臟毒性, 引起致突變、致癌和致畸[11]。各國都致力于嚴格監控這些毒素的含量，我國標準GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[12]規定花生制品的AFTB1限值為20 μg/kg，其他制品為5.0 μg/kg，OTA限值為5.0 μg/kg。

目前5種真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫法、高效液相色譜法及高效液相色譜-串聯質譜法[13-16]，酶聯免疫法雖然校測效率高，但靈敏度和準確度較低。高效液相色譜法為常見的檢測方法，但只能檢測單一類毒素，對多毒素樣品的測定需要較大時限。而高效液相色譜-串聯質譜法的靈敏度、準確性及選擇性都較高。由于近些年昆明市售芝麻醬和花生醬存在一定霉菌污染情況[17-18]，本文針對云南市售芝麻醬、花生醬和黃豆醬樣品，通過優化樣品前處理條件，采用內標法準確定量，建立5種真菌毒素同時檢測的高效液相色譜-串聯質譜法，為政府相關職能部門提供了技術及數據支持，保障了居民的食用及健康安全。

1 材料與方法

1.1 材料

檢測樣品由云南紅河、曲靖、楚雄、大理和昆明5州市疾病預防控制中心進行采集提供，每個地方分別采集花生醬、芝麻醬和黃豆醬每類樣品2件，共計30件。

1.2 儀器與試劑

1290 InfinityⅡ超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀 美國Agilent Technologies公司；QTRAP 4500超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀 美國AB SCIEX公司；XS205DU分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；3H16RI智能臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

標準物質AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、OTA和同位素內標13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2、13C20-OTA(10.2 μg/mL)以及質控樣MRM-AC-2909和MRM-AW-0211：均購于Pribolab中國公司；甲醇和乙腈：均為色譜純，購于美國Sigma-Aldrich公司；質控樣Lot#M15361A：購于Romer Labs公司。

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm), 柱溫為40 ℃, 流動相A相：甲醇∶乙腈混合體積比1∶1，B相：0.2%甲酸水溶液。流速為0.3 mL/min, 進樣體積為10 μL, 分析運行時間為6.0 min。

1.4 質譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描模式，離子源溫度為550 ℃；離子噴霧電壓為5500 V；氣簾氣(curtain gas)為25 psi；霧化氣(gas 1)為55 psi；輔助氣(gas 2)為55 psi；多反應監測模式測定(MRM)。

1.5 實驗方法

1.5.1 標準溶液配制

分別將5種標準物質用乙腈稀釋至濃度為1.0 μg/mL儲備液，同位素內標液用乙腈稀釋為0.5 μg/mL工作液，再用乙腈水溶液(2∶8，體積比)配制標準系列，標準系列中每個溶液點內標含量均為1.0 μg/L，分別儲存于-20 ℃條件下。

1.5.2 樣品前處理

精確稱取試樣(2±0.01) g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸溶液(70∶29∶1，體積比)于多功能渦旋振蕩器上提取30 min，離心機10000 r/min離心5 min，取10 mL上清液用氮吹濃縮至近干，加入同位素內標工作液，使樣品中含量均為1.0 μg/L，乙腈水溶液(2∶8，體積比)定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，用高效液相色譜-串聯質譜測定分析。

2 結果與分析

2.1 檢測模式的選擇

通過對5種真菌毒素標準物質和同位素內標的母離子和子離子進行尋找，在相同濃度條件的檢測中，負離子模式下響應強度為104左右，而正離子模式下響應強度可達106，并且AFTG2和OTA的子離子在負離子模式下較少分裂產生碎片離子峰，響應強度基本在103附近，在正離子模式下5種真菌毒素有較好的二級質譜碎片離子分裂情況，響應強度較明顯，因此選擇正離子模式測定分析樣品。

2.2 色譜條件的優化

通過對流動相組成和配比進行考察，B相為純水時目標峰的響應強度較低甚至未出現目標峰，加入甲酸后目標峰的響應強度有顯著加強。A相為單一有機相時目標化合物的分離度較小，當為混合有機相時能達到較好的分離效果，目標化合物的總離子圖見圖1。因此確定了甲醇-乙腈按1∶1體積比混合為A相，0.2%甲酸水為B相，洗脫程序：0～1.0 min，60% B；1.0～2.0 min，60% B～30% B；2.0～3.0 min，30% B～0% B；3.0～3.5 min，0% B；3.5～4.5 min，0% B～30% B；4.5～5.5 min，30% B～60% B；5.5～6.0 min，60% B。

2.3 質譜條件的優化

依次將5種真菌毒素儲備液及同位素內標工作液稀釋至500.0 μg/L，在流動注射狀態下，利用Q1 MS全掃描以及Product Ion Scan(MS2)碎片離子掃描模式分別進行各真菌毒素的一級、二級質譜碎片離子尋找，取響應程度較高的前2個碎片離子作為定量和定性離子, 通過儀器MRM掃描模式優化去簇電壓及碰撞能量參數，詳細參數見表1，在此條件下5種真菌毒素的總離子色譜圖見圖1，各真菌毒素的碎片離子MRM譜圖見圖2。

表1 5種真菌毒素及同位素內標的質譜參數Table 1 The mass spectrum parameters for five mycotoxins and isotope internal standard

圖1 5種真菌毒素在10 μg/L濃度的總離子色譜圖Fig.1 The TIC of five mycotoxins at 10 μg/L

圖2 5種真菌毒素在10 μg/L濃度的MRM色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of five mycotoxins at 10 μg/L

2.4 樣品提取凈化的優化

考察了不同提取溶劑對5種真菌毒素回收率及質控樣測定值的影響，70%乙腈-水具有96%的提取效率，為所對比提取溶劑中最高值，加入1%的甲酸可以加強5種真菌毒素的穩定性，提高實驗測定值的重現性。由于樣品基質復雜情況不同，而免疫親和柱對真菌毒素特異選擇性不同，且對于基層實驗室使用成本較高，采用物理吸附的多功能凈化柱，可吸附大部分干擾雜質，操作步驟較為簡單，很大程度上提高了樣品的凈化效率，通過同位素內標的定量可以滿足實驗室的檢測要求。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系及檢出限

通過上述優化的樣品前處理條件和色譜及質譜條件，對樣品進行真菌毒素的測定，以定量離子峰的峰面積為縱坐標、質量濃度(μg/L)為橫坐標繪制標準曲線，在所檢測的濃度范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均在0.9990以上。以3倍信噪比(S/N)對應的濃度為方法檢出限，10倍信噪比對應的濃度為方法定量限，詳細數據見表2。

表2 5種真菌毒素的線性關系、檢測限

2.5.2 方法的回收率

選取花生醬基質樣品進行加標回收實驗，分別添加混合真菌毒素標準溶液至濃度為1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照樣品前處理條件進行處理并上機測定，每個添加濃度做6個平行實驗，5種真菌毒素的平均回收率為87.1%～103.4%，并計算相對標準偏差(RSD)作為方法的精密度，結果為1.18%～5.26%，具體結果見表3。

表3 5種真菌毒素的加標回收率和精密度(n=6)

2.6 質量控制

分別精確稱取3種真菌毒素質控樣,依據樣品前處理方法進行處理,檢測結果均符合標準證書要求，結果見表4。

表4 準確度數據Table 4 The accuracy data μg/kg

樣品的加標回收率、精密度以及質控樣品的測定數據表明，芝麻醬、花生醬和黃豆醬樣品按照此種方法提取凈化分析，具有較高的提取效率，準確度較好。

2.7 樣品檢測分析

30件樣品中，真菌毒素的檢出情況根據樣品種類存在明顯的差異，花生醬樣品中有4件檢出AFTB1，檢出率為40%，其中2件檢測結果超過國家標準規定限值20 μg/kg，超標率為20%，2件檢出AFTB2，檢出率為20%，其他毒素未檢出；芝麻醬樣品中有1件檢出AFTB1，且檢測結果超過國家標準規定限值5.0 μg/kg，檢出率和超標率均為10%，其他毒素未檢出；黃豆醬樣品中真菌毒素均未檢出。從整批次樣品統計來分析，5件檢出AFTB1，檢出率為16.7%；3件超標，超標率為10%；2件檢出AFTB2，檢出率為6.7%；其余均為未檢出。云南市售芝麻醬和花生醬中真菌毒素的污染情況不容樂觀，應引起相關政府職能部門的重視，檢出情況見表5。

表5 真菌毒素含量檢出詳情Table 5 The detecting details of mycotoxins' content

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定芝麻醬、花生醬和黃豆醬中5種真菌毒素的檢測方法，該方法的樣品前處理簡單、檢測便捷，整個實驗的靈敏度和準確度高，回收率好，可以滿足日常監測工作對多種調味制品中5種真菌毒素的同時定性定量檢測分析要求。