枇杷-梨復合果醋發酵工藝的研究

孟金明，劉秋鳴，熊思敏，張霞，吳娜

(紅河學院 理學院，云南 蒙自 661100)

枇杷果肉軟而多汁，具有獨特的果香味，且含有人體所需的多種維生素以及礦物質元素[1]。梨是我國的三大水果之一，其中含有蛋白質、膳食纖維、有機酸、多種維生素和礦物質以及豐富的酚類物質[2-3]。果醋是主要以水果為原材料經過酒精發酵和醋酸發酵兩次發酵工藝釀制而成的一種新型飲品，果醋不僅保留了水果原材料中很多營養成分，而且經過微生物的發酵作用產生了原材料中所不具有的多種功能性成分，因此果醋具有較好的保健功能[4]。隨著人們生活水平的不斷提高，傳統模式的食品逐漸開始淡出人們的視野，如今人們更加注重食物的營養性和健康性[5-7]。目前國內利用水果及蔬菜等原料進行果醋釀造的研究也越來越多，而對于枇杷和貢梨的研究主要集中在保鮮等方面[8-9]。本試驗以貢梨和蒙自長虹枇杷為原料，釀制風味獨特、果香濃郁、酸甜爽口的果醋產品，不僅可以解決水果資源因不易貯藏和保鮮造成的浪費問題，而且為枇杷和貢梨的深加工產業提供了理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料為蒙自長虹枇杷和市售貢梨。纖維素酶(80000 U/g)、果膠酶(80000 U/g)、焦亞硫酸鉀、檸檬酸：友誼食品添加劑公司；安琪果酒酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌：上海迪發釀造生物制品有限公司；食用酒精：河南河陽酒精實業有限公司；維生素C、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、碳酸氫鉀：均為分析純(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；試驗室用水均使用蒸餾水。

GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司；MQW-63G型恒溫振蕩培養箱 上海旻泉儀器有限公司；CP224C型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器有限公司；LB90A手持糖度計 廣州市銘睿電子科技有限公司；JYL-Y15型九陽高速破壁調理機 九陽股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 枇杷-梨復合果醋的發酵工藝流程

①枇杷：挑選枇杷→清洗→熱燙→去皮、去核→護色液浸泡→打漿。
②梨：挑選梨→清洗→去皮、切塊→護色液浸泡→打漿。
活性干酵母→活化→酵母活化液
↓
①+②按比例混合→酶解→二氧化硫處理→成分調整→接種→
酒精發酵→過濾→成分調整→接種→醋酸發酵→測定。
↑
醋酸菌活化液←活化和擴大培養←醋酸菌

1.2.2 工藝流程中的操作要點

1.2.2.1 原料挑選與前處理

挑選出成熟度良好、外表無明顯機械損傷的枇杷，取適量放入沸水中熱燙20～30 s，熱燙后放入冷水中，去除果皮和果核，將果肉放入含有0.15%檸檬酸和0.05%維生素C的護色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.1%維生素C放入榨汁機中打漿。挑選中等大小的、無腐爛或變質的貢梨，去皮，將果肉切成小塊放入護色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.05%維生素C放入榨汁機中打漿。

1.2.2.2 枇杷-梨復合果醋酒精發酵條件的確定

通過前期試驗確定枇杷-梨復合果醋酒精發酵階段的條件：枇杷汁與貢梨汁的比例為1∶2(V/V)，初始pH為4.6，SO2添加量為61 mg/L，發酵溫度為22 ℃，初始糖度為21%，酵母添加量為0.2%，在以上條件下發酵所得枇杷-梨復合果醋具有較好的風味、色澤和酒精度。

1.2.2.3 醋酸菌活化

種子培養基的配比：1.5 g葡萄糖、1 g酵母膏、2 g碳酸鈣和100 mL蒸餾水。培養基滅菌后，冷卻至室溫，在無菌條件下向每瓶培養基中加入2.1 mL食用酒精和1.05 g醋酸菌，最后放入振蕩培養箱中，培養溫度為31 ℃，轉速為180 r/min，培養72 h。種子液經3 d培養至酸度值達到2.4 g/dL以上時即可使用，將調整成分后的果酒分裝入250 mL錐形瓶中，在無菌條件下接入醋酸菌種子液，用4層紗布封口后放入振蕩培養箱中，調整發酵溫度和轉速進行發酵。

1.2.3 理化成分測定

醋酸的測定：采用電位滴定法[10]。

1.2.4 枇杷-梨復合果醋發酵單因素試驗

1.2.4.1 枇杷-梨復合果醋發酵時間的確定

調整發酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL果酒液裝入250 mL三角瓶中，然后接入7%的醋酸菌，置于31 ℃下，分別在發酵第3，5，7，9，11天測定其酸度值，分析果醋酸度值隨發酵時間變化的規律，確定醋酸發酵的最佳時間。

1.2.4.2 枇杷-梨復合果醋醋酸菌接種量的確定

調整發酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL發酵液裝入250 mL錐形瓶中，分別接入3%、5%、7%、9%、11%的醋酸菌接種量，置于31 ℃下，發酵9 d，分別測定其酸度值，分析果醋酸度值隨醋酸菌接種量變化的規律，確定最優的醋酸菌接種量。

1.2.4.3 枇杷-梨復合果醋裝液量的確定

調整發酵液的初始酒精度為8% vol，分別將60，70，80，90，100 mL發酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，置于31 ℃下，發酵9 d，分別測定其酸度值，分析果醋酸度值隨裝液量變化的規律，確定最優的裝液量。

1.2.4.4 枇杷-梨復合果醋初始酒精度的確定

分別調整發酵液的初始酒精度為5% vol、6% vol、7% vol、8% vol、9% vol，將70 mL發酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，置于31 ℃下，發酵9 d，分別測定其酸度值，分析初始酒精度對果醋酸度的影響，確定果醋發酵的初始酒精度。

1.2.4.5 枇杷-梨復合果醋發酵溫度的確定

調整發酵液的初始酒精度為8% vol，將70 mL發酵液裝入250 mL錐形瓶中，醋酸菌接種量為7%，分別置于27，29，31，33，35 ℃下，發酵9 d，分別測定其酸度值，分析發酵溫度對果醋酸度的影響，確定果醋發酵的最佳發酵溫度。

1.2.5 枇杷-梨復合果醋發酵條件響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，選取發酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)3個因素為自變量，以酸度值(Y)作為響應值，采用三因素三水平的響應面分析方法對復合果醋的發酵工藝條件進行優化，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面分析試驗因素水平及編碼表

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 枇杷-梨復合果醋發酵條件的單因素試驗

2.1.1 不同發酵時間對枇杷-梨復合果醋酸度的影響

由圖1可知，發酵3 d后果醋的總酸度就達到了35 g/L左右，因為枇杷-梨復合果醋酒精發酵階段結束后的發酵液具有一定的酸度，再加上接入的醋酸菌種子液也有一定的酸度，因此會造成發酵液的初始酸度較高。從發酵的第3天到第5天醋酸菌大量繁殖，消耗發酵液的乙醇大量合成醋酸，使得發酵液的總酸含量迅速上升；當發酵5 d以后，隨著發酵液中乙醇、糖類等營養物質的減少，醋酸菌的醋酸代謝減緩，進而發酵液的總酸含量上升的速度變緩；當發酵時間在9 d之后，發酵液的總酸基本趨于平穩，發酵液的總酸含量達到51.27 g/L，這時發酵液中的營養物質基本消耗殆盡而且酸度很高，醋酸菌的醋酸發酵基本結束[11]。因為醋酸發酵過程在9 d基本結束，總酸含量也已經達到40 g/L以上，綜合時間成本，因此選擇枇杷-梨復合果醋的醋酸發酵時間為9 d。

圖1 發酵時間對枇杷-梨復合果醋酸度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.2 不同醋酸菌接種量對枇杷-梨復合果醋酸度的影響

由圖2可知，當醋酸菌的接種量處于一個較低的水平3%時，導致醋酸菌在發酵液中的總量偏少，不具備較好的產酸能力，導致發酵液中的酒精不能盡快地轉化為醋酸，而且會使果醋發酵的周期延長，增大發酵染菌的幾率。當醋酸菌的接種量為3%～7%時，復合果醋的酸度隨著接種量的增加而呈現大幅度上升的趨勢，接種量為7%時果醋的酸度達最高值，為51.15 g/L，然而當接種量大于7%后，醋酸菌的生長繁殖明顯增快，發酵液中醋酸菌數量的激增，一方面會消耗過多的營養成分，另一方面會過早地進入衰亡期，大量菌體老化以及自溶，從而影響醋酸發酵過程，果醋的酸度呈現緩慢下降的趨勢[12]。通過顯著性分析可以看出，接種量為7%與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，因此選取復合果醋發酵的最適醋酸菌接種量為7%。

圖2 醋酸菌接種量對枇杷-梨復合果醋酸度的影響Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.3 不同裝液量對枇杷-梨復合果醋酸度的影響

由圖3可知，復合果醋的酸度值隨著發酵液裝液量的升高而呈現下降的趨勢。因為本試驗使用250 mL錐形瓶進行果醋發酵，隨著發酵液裝液量的增多，錐形瓶中的空氣柱越小，因此導致發酵液的含氧量降低，從而影響醋酸菌的生長繁殖，由于復合果醋的醋酸發酵過程是振蕩培養，因此裝液量過高還會導致發酵液污染封口的紗布，使得發酵液受雜菌污染的幾率增加[13]。當裝液量為100 mL時發酵所得的果醋酸度值最低，裝液量為60 mL和70 mL時酸度值在52 g/L左右，兩者差異不顯著(P>0.05)；但由于60 mL的裝液量到發酵結束后發酵液會有少量損失，不利于對其進行酸度值的檢測，并且在酸度值相似的情況下，70 mL的裝液量可以提高果醋的生產率，因此選取70 mL為果醋發酵最適的裝液量。

圖3 裝液量對枇杷-梨復合果醋酸度的影響Fig.3 Effect of liquid loading volume on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.4 不同初始酒精度對枇杷-梨復合果醋酸度的影響

在復合果醋發酵階段，醋酸菌將會利用果酒中的乙醇和殘糖等營養物質來進行醋酸的代謝，所以初始發酵液中的乙醇含量直接影響發酵液中醋酸菌的產酸量[14]。由圖4可知，果醋的酸度值隨著初始酒精度的增大呈先升高后降低的趨勢，當初始酒精度為7% vol時，發酵液的酸度值達到最高53.24 g/L，隨著初始酒精度的繼續升高，酸度值反而呈現下降的趨勢，因為初始發酵液中的乙醇過多會降低醋酸菌的代謝活力，不利于醋酸菌的生長，使得發酵液中醋酸菌的數量不能在短時間內達到要求，從而導致整個發酵周期的延長，在發酵結束時復合果酸的酸度值偏低[15]。通過顯著性分析可以得出，初始酒精度為7% vol與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，所以選取最佳的初始酒精度為7% vol。

圖4 初始酒精度對枇杷-梨復合果醋酸度的影響Fig.4 Effect of initial alcohol degree on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.5 不同發酵溫度對枇杷-梨復合果醋酸度的影響

溫度對醋酸菌的生長有著重要的影響，溫度過高或過低都會對醋酸菌體內酶的活性造成影響，從而影響醋酸菌的醋酸代謝，而且不同的醋酸菌最適的發酵溫度也不盡相同[16]。由圖5可知，當發酵溫度為27 ℃時，醋酸菌的生長十分緩慢，發酵液的菌體數量偏低，從而導致復合果醋的酸度值較低；隨著發酵溫度的升高，所得果醋的酸度值不斷升高，并在31 ℃時達到最大值52 g/L。當發酵溫度高于31 ℃之后，醋酸菌的產酸量又呈現下降趨勢，因為發酵溫度較高時醋酸菌大量增殖，發酵會過早進入衰亡期，菌體大量老化以及自溶，使得所得復合果醋的酸度值偏低[17]。通過顯著性分析可以得出，發酵溫度為31 ℃與其他幾個處理組的酸度值均具有顯著性差異(P<0.05)，所以選擇發酵溫度為31 ℃最佳。

圖5 發酵溫度對枇杷-梨復合果醋酸度的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.2 枇杷-梨復合果醋發酵條件響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上選取對復合果醋發酵影響較大的因素發酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)作為考察因素，以果醋酸度值作為響應值 (Y) ，設計三因素三水平的響應面優化試驗，響應面試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 The results of Box-Behnken central composite design

2.2.2 響應面回歸方程模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 10軟件對表2中得到的試驗結果進行多元線性回歸擬合，可以得到枇杷-梨復合果醋的酸度(Y)對應醋酸發酵中發酵溫度(A)、接種量(B)和初始酒精度(C)的回歸方程模型為：Y=53.46-1.34A+1.53B+0.83C-0.98AB-1.63AC-0.62BC-3.24A2-3.92B2-2.76C2，方程中Y為酸度，A、B、C分別表示3個影響因素各自對應的編碼值。對枇杷-梨復合果醋的試驗結果進行回歸方程模型的方差顯著性檢驗，結果見表3。

表3 回歸方程模型的方差和顯著性分析Table 3 The variance and significance analysis of regression equation model

續 表

由表3可知，本試驗中模型的P值<0.0001，極顯著；失擬項的P值為0.8457，不顯著，可得出試驗所得模型擬合性較好，該模型中各個影響因素的相關系數R2為0.9931，說明該模型能夠對實際試驗中99%以上的響應值做出解釋，因此本模型適用于分析和預測枇杷-梨復合果醋的發酵工藝條件。由表3中還可以得出自變量一次項A、B、C均具有極顯著差異(P<0.01)；交互項中，AB、AC有極顯著差異(P<0.01)，BC具有顯著差異(P<0.05)，模型交互效應影響顯著；二次項系數A2、B2、C2的P值均<0.0001，模型的曲面效應極顯著[18]。根據F值的大小可得出各發酵工藝因素對枇杷-梨復合果醋的酸度值的影響大小為：醋酸菌接種量(B)>發酵溫度(A)>初始酒精度(C)。

2.2.3 試驗因素的交互作用分析

從Design-Expert 10響應面分析軟件中得到的兩兩因素間的三維曲線圖和等高線圖見圖6～圖8。根據這3個因素對酸度值所形成的三維曲線圖可以較好地反映出發酵溫度、初始酒精度和接種量這3個因素之間的交互作用對枇杷-梨復合果醋酸度的影響情況，曲面的傾斜程度越大則說明此因素對果醋酸度值的影響越大。等高線圖中圖形的形狀可以反映出各因素之間交互作用的顯著程度，圖形為橢圓形則表示兩個因素的交互作用顯著[19-20]。

由圖6可知，發酵溫度和接種量交互形成的曲面坡度較大，說明其對酸度的影響較大，其等高線圖近似橢圓形，說明交互作用較顯著；由圖7可知，發酵溫度和初始酒精度交互形成的曲面坡度陡峭，說明其對酒精度的影響較大，并且等高線圖呈橢圓形，說明兩者的交互作用極顯著；由圖8可知，接種量和初始酒精度交互形成的曲面坡度較大，而且等高線圖呈橢圓形，說明這兩個因素的交互作用比較顯著。

圖6 發酵溫度和接種量交互影響酸度的響應面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and acetic acid bacteria inoculation amount interaction on the acidity value

圖7 發酵溫度和初始酒精度交互影響酸度的響應面圖和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and initial alcohol degree interaction on the acidity value

圖8 接種量和初始酒精度交互影響酸度的響應面圖和等高線圖Fig.8 The response surface and contour plot of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and initial alcohol degree interaction on the acidity value

2.2.4 最佳發酵條件的預測與檢驗

通過響應面分析試驗可得出枇杷-梨復合果醋的最佳發酵參數：溫度為32.103 ℃，接種量為7.258%，初始酒精度為6.973% vol，此預測條件下可得到果醋酸度為51.792 g/L。根據實際可操作性，將發酵溫度調整為32 ℃，接種量調整為7.3%，初始酒精度調整為7% vol，結合單因素試驗結果再將發酵時間設定為9 d、裝液量設定為70 mL進行響應面驗證試驗。在此條件下發酵所得復合果醋的酸度值為51.65 g/L，實際值與理論值相差較小，用此模型進行試驗設計和數學模型具有可靠性。

3 結論

采用單因素試驗和響應面分析試驗，對枇杷-梨復合果醋醋酸發酵過程中主要發酵條件進行優化，得出對復合果醋酸度影響最大的是醋酸菌接種量，其次是發酵溫度，而初始酒精度的影響最小；枇杷-梨復合果醋醋酸階段的最佳發酵工藝條件為：發酵溫度為32 ℃，接種量為7.3%，初始酒精度為7% vol。在此最優條件下復合果醋的酸度為51.65 g/L，所得果醋呈淡黃色，澄清透明，果香濃郁，口感醇厚。枇杷-梨復合果醋的研制不僅可以解決枇杷和貢梨在鮮果銷售過程中的腐敗浪費，而且可以為枇杷和貢梨的深加工工藝提供理論依據，提高農產品的附加價值，推動果醋產業的發展。