微生物發酵法制備鮮辣沙蟹汁工藝研究

崔瑩瑩，李明燕，翟興偉，童光森

(四川旅游學院 烹飪學院，成都 610100)

沙蟹汁是北部灣沿海特有的發酵類調味品，其味道鮮美，常用來烹飪沙蟹汁燜豆角等口味咸鮮的菜肴，亦可以作為白切類菜肴、各式火鍋的蘸料，擁有非常好的市場潛力[1]。但是因傳統沙蟹汁以海灘野生沙蟹作為原料，經初加工處理后加鹽進行自然發酵，腥異味較重，對其推廣有一定的制約。

微生物發酵法是食品工業常用的風味改良方法，通過微生物發酵作用將發酵類制品中的腥異味物質轉化為無腥異味或降低腥異味程度，同時還能豐富發酵類制品的醇厚度，從而進一步提升發酵類制品的品質[2]。目前發酵制品生產企業多采用復合菌種混合發酵方法，在縮短發酵周期的同時還能彌補單一菌種發酵的缺陷。傳統沙蟹汁以咸鮮口味為主，口味較為單一，除微生物發酵法對其發酵過程中的腥異味有一定的抑制作用外，還可以通過添加其他風味食材進一步改良其風味。鮮辣風味目前在國內餐飲中較受歡迎，在保留咸鮮風味基礎上增加了辣味，不僅能開胃改善味覺感受，而且能起到增鮮解膩的作用。在沙蟹汁的制備過程中增加辣味食材，不僅能進一步改良其風味，而且能豐富沙蟹汁產品的種類，為餐飲行業提供一款鮮辣咸鮮的調味制品，進一步滿足消費者的需求。

基于此，本文以沙蟹與辣椒為原料，在傳統發酵工藝的基礎上添加魯氏酵母菌和植物乳桿菌進行發酵，通過單因素實驗與正交實驗進一步優化鮮辣沙蟹汁的制備工藝，并比較分析微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁與傳統發酵法的風味差異，為沙蟹汁系列產品的開發提供了參考，為相關研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 食材和試劑

沙蟹：購于北海市鮮而美食品有限公司；辣椒、鹽：購于成都市青羊區麥德龍超市；植物乳桿菌和魯氏酵母菌：購于中國科學院成都生物研究所；MRS液體培養基、YPD液體培養基：購于成都市富瑞達生物技術有限公司；其他試劑：均為國產分析純。

1.1.2 儀器和設備

DC-PB02多功能料理機 合肥榮事達電子電器集團有限公司；HT-400B恒溫培養箱 上海赫田科學儀器有限公司；GJB1000-60均質機 常州市均質機械有限公司；L-8900氨基酸分析儀 日立公司；LC210高效液相色譜儀 上海儀電分析儀器有限公司；DL5M冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司；其他設備由四川旅游學院烹飪科學重點實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮辣沙蟹汁的制備與處理

1.2.1.1 發酵菌種制備

參考陳蕾蕾等[3]的方法。將植物乳桿菌接種到MRS液體培養基中，于恒溫培養箱在35 ℃條件下振蕩培養15 h至活力恢復。將魯氏酵母菌接種到YPD液體培養基中，于恒溫培養箱在30 ℃條件下振蕩培養35 h至活力恢復。培養結束后將兩種菌懸液分別在4 ℃條件下以4000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀并溶于0.85%滅菌生理鹽水中，分別調整濃度為108CFU/mL，通過兩種菌種單獨發酵實驗確定最佳接種量，并確定混合比例。

1.2.1.2 傳統發酵法制備

參考劉天天[4]的方法。在預實驗基礎上按微生物發酵法最佳原料配方取沙蟹、辣椒、鹽混合，放入多功能料理機中速粉碎3 min，加入蒸餾水500 g，然后放入均質機以6000 r/min均質10 min，放入發酵罐中，常溫晾曬發酵25 d，成品即為傳統發酵法制備鮮辣沙蟹汁。

1.2.1.3 微生物發酵法制備

參考范思華[5]的方法。在預實驗基礎上取沙蟹、辣椒、鹽混合，放入多功能料理機中速粉碎3 min，加入菌種與蒸餾水500 g，然后放入均質機以6000 r/min均質10 min，放入恒溫培養箱中發酵，按2 d/次的頻率攪拌，發酵結束后成品即為微生物發酵法制備鮮辣沙蟹汁。

1.2.1.4 上清液制備

將成品鮮辣沙蟹汁攪拌均勻，并于5500 r/min條件下離心10 min，取上清液保存于-20 ℃備用。

1.2.2 單因素實驗

在預實驗基礎上確定微生物發酵法制備鮮辣沙蟹汁的基礎工藝條件及配方：發酵時間18 d，發酵溫度28 ℃，復合發酵劑添加量30 mL，沙蟹1000 g，辣椒300 g，鹽300 g。固定沙蟹1000 g的量不變，改變其他因素，以感官評價和氨基酸態氮含量為指標進行單因素實驗。各因素變量值分別為：發酵時間12，14，16，18，20，22，24 d，發酵溫度25，26，27，28，29，30，31 ℃，復合發酵劑接種量24，26，28，30，32，34，36 mL，辣椒添加量200，240，280，320，360，400，440 g，鹽添加量240，260，280，300，320，340，360 g；鮮辣沙蟹汁制備結束后，樣品冷卻備用。

1.2.3 正交實驗優化最佳工藝

在單因素實驗基礎上確定發酵時間、發酵溫度、復合發酵劑添加量、辣椒添加量、鹽添加量5個因素為自變量，每個因素取最佳的3個水平，以感官評分為正交實驗指標，通過L9(35)實驗確定最佳工藝配方，具體因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 感官評價

參考李銳等[6]的方法。挑選10名具有食品相關專業背景的感官評價員，其中5名男性，5名女性，年齡在20～25歲。感官評價采用感官描述法對鮮辣沙蟹汁進行感官屬性分析，在鑒定前對評價人員進行培訓。樣品經水浴加熱至45 ℃，隨機取樣進行感官評價，分別從色澤、氣味、滋味和組織狀態方面進行評價，取平均分為最終結果，具體感官評定標準見表2。

表2 感官評定標準Table 2 The sensory evaluation criteria

1.2.5 其他理化指標的測定

氨基酸態氮含量的測定參考張一江等[7]的方法，采用甲醛滴定法；揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定參考李鑫星等[8]的方法，采用半微量定氮法；游離氨基酸含量的測定采用GB 5009.124-2016的方法。

1.3 數據處理

實驗結果用平均值±標準偏差表示(n=3)，使用Excel 2010和IBM SPSS 22.0軟件進行作圖和數據分析[9]。

2 結果與分析

2.1 復合發酵菌種比例的確定

氨基酸態氮是檢驗發酵類食品發酵程度的重要指標，鮮辣沙蟹汁在發酵過程中，蛋白質會被分解產生氨基酸等含氮化合物，其濃度是影響滋味的重要因素[10]。在文獻研究的基礎上，分別添加1%～6%的植物乳桿菌和魯氏酵母菌進行發酵，由圖1和圖2可知，植物乳桿菌接種量在4%時，其氨基酸態氮含量最高；魯氏酵母菌接種量在5%時，其氨基酸態氮含量最高，結合兩種發酵菌最適合接種量，最終確定菌種混合比例為4∶5。

圖1 植物乳桿菌對發酵過程中氨基酸態氮含量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum on the content of amino acid nitrogen during fermentation

圖2 魯氏酵母菌對發酵過程中氨基酸態氮含量的影響Fig.2 Effect of Saccharomyces rougii on the content of amino acid nitrogen during fermentation

2.2 單因素實驗

2.2.1 發酵時間對氨基酸態氮含量和感官評分的影響

鮮辣沙蟹汁在發酵過程中，發酵時間直接影響氨基酸態氮的含量，在發酵初期，受酶和微生物作用，蛋白質被分解，氨基酸態氮含量增加，當其趨于穩定說明基本分解完成，鮮辣沙蟹汁制備完成[11]。由圖3可知，隨著發酵時間延長，感官評分增加，在發酵第18天時，感官評分和氨基酸態氮含量均達到最大值，說明此時鮮辣沙蟹汁發酵已趨于成熟，繼續發酵，受有機酸等次級代謝產物的影響使其品質下降。最終確定16，18，20 d作為正交實驗數值。

圖3 發酵時間對氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.2 發酵溫度對氨基酸態氮含量和感官評分的影響

菌種在發酵過程中受溫度的影響較大，發酵溫度過低，菌株代謝緩慢，不利于風味物質形成；溫度過高，微生物代謝易被抑制，導致風味物質及氨基酸態氮含量下降[12]。由圖4可知，發酵溫度在29 ℃時氨基酸態氮含量與感官評分最高，因此發酵溫度29 ℃較為適宜，綜合分析選擇28，29，30 ℃作為正交實驗發酵溫度。

圖4 發酵溫度對氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.3 接種量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響

發酵菌種接種量過低，發酵不充分，不利于風味物質的產生，接種量過高容易產生酵母味、酸味和酒精味，直接影響鮮辣沙蟹汁成品的品質[13]。由圖5可知，隨著接種量的增加，其感官評分和氨基酸態氮含量均呈先上升后下降的趨勢，接種量為26 mL時品質最佳，最終確定24，26，28 mL 3個接種量作為正交實驗數值。

圖5 接種量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.4 辣椒添加量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響

在其他發酵工藝恒定的前提下，分析不同辣椒添加量對鮮辣沙蟹汁發酵品質的影響。由圖6可知，隨著辣椒添加量的增加，氨基酸態氮變化幅度不明顯，添加量為320 g時達到最大值，與感官評分標準一致。辣椒在鮮辣沙蟹汁中主要影響其辣度，過多或過少會出現成品辣味不足或過辣等問題，辣椒素對微生物有一定抑制作用，對發酵效果有一定影響。結合氨基酸態氮與感官評分結果，最終確定280，320，360 g 3種添加量作為正交實驗數值。

圖6 辣椒添加量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.6 Effect of chili additive amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.5 鹽添加量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響

鮮辣沙蟹汁在發酵過程中，鹽的添加能有效地抑制腐敗微生物的繁殖，但是其也可以影響蛋白酶作用、氨基酸態氮的含量、成品的咸度[14]。由圖7可知，隨著鹽添加量的增加，氨基酸態氮含量和感官評分先呈上升趨勢，在320 g時達到最高值，說明隨著鹽添加量增加，鹽有效地抑制了腐敗微生物的繁殖，對氨基酸態氮含量的影響較小，但是隨著鹽添加量繼續增加，氨基酸態氮含量和感官評分呈下降趨勢。綜合分析，鹽的添加量選取300，320，340 g作為作為正交實驗數值。

圖7 鹽添加量對氨基酸態氮含量和感官評分的影響Fig.7 Effect of salt additive amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.3 正交實驗優化鮮辣沙蟹汁的制備工藝

根據表3結合方差分析結果，以氨基酸態氮為指標的正交實驗結果表明發酵時間和鹽的添加量對鮮辣沙蟹汁的影響極顯著(P<0.01)，發酵溫度和接種量對其有顯著影響(P<0.05)，即RA>RE>RD>RC>RB，最佳配方為A2B2C2D3E3；以感官評分為指標的正交實驗結果表明發酵時間對鮮辣沙蟹汁的影響極顯著(P<0.01)，接種量、辣椒添加量和鹽添加量對其有顯著影響(P<0.05)，即RA>RE>RC>RD>RB，最佳配方為A2B2C2D3E3；兩個正交實驗指標最佳配方一致，最終確定微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁的最佳配方為A2B2C2D3E3，即以沙蟹添加量1000 g為基礎，發酵時間18 d，發酵溫度29 ℃，接種量26 mL，辣椒360 g，鹽340 g。

表3 正交實驗表

表4 正交實驗結果分析表Table 4 The orthogonal test results analysis table

表5 方差分析Table 5 The analysis of variance

2.4 微生物發酵法與傳統方法制備鮮辣沙蟹汁品質比較

2.4.1 感官評分、氨基酸態氮和揮發性鹽基氮的含量比較

由圖8可知，微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁感官評分為94.12，與傳統發酵法相比增加了6.53%；微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁氨基酸態氮和揮發性鹽基氮含量分別為8.89，1.05 mg/mL，與傳統發酵法制備的鮮辣沙蟹汁相比，氨基酸態氮含量增加了9.48%，揮發性鹽基氮含量下降了22.22%。感官評分為消費者直接的感官感受，其評分增加了6.53%，說明微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁品質有效地提高了發酵品質。發酵菌種中的植物乳桿菌和魯氏酵母菌在發酵過程中可以將大分子蛋白轉化為小分子肽和氨基酸等鮮味物質，使鮮辣沙蟹汁的風味更加鮮美。揮發性鹽基氮的下降說明在發酵過程中復合發酵劑能使鮮辣沙蟹汁中的有機酸含量增加，對腐敗微生物生長有一定的抑制作用。綜合分析，微生物發酵法與傳統發酵法制備的鮮辣沙蟹汁在感官評分及氨基酸態氮和揮發性鹽基氮含量等方面均具有優勢，能有效地改善成品的品質。

圖8 兩種發酵法的感官評分及氨基酸態氮和揮發性鹽基氮含量Fig.8 The sensory scores and content of amino acid nitrogen and TVB-N of two fermentation methods

2.4.2 游離氨基酸含量比較

鮮辣沙蟹汁鮮味的主要來源為游離氨基酸，其含量是判斷成品品質的重要指標[15]。由表6可知，傳統發酵法制備的鮮辣沙蟹汁中游離氨基酸總量為2609.85 mg/100 g，鮮味氨基酸含量為481.69 mg/100 g，甜味氨基酸含量為164.71 mg/100 g，鮮味與甜味氨基酸含量占總量的24.76%。微生物發酵法制備的鮮辣沙蟹汁游離氨基酸總量和鮮味與甜味氨基酸含量分別增加了12.98%和44.09%；結合文獻分析，發酵菌種中的植物乳桿菌和魯氏酵母菌有效豐富了氨基酸的種類和含量，有效提高了產品中游離氨基酸的含量，使成品的感官評分和風味更優。綜合分析，鮮辣沙蟹汁添加發酵菌種后，游離氨基酸總量和鮮味、甜味氨基酸含量有顯著增加，提高了鮮辣沙蟹汁的風味品質。

表6 兩種發酵法的游離氨基酸含量

3 結論

通過單因素實驗結合正交實驗確定了鮮辣沙蟹汁的最佳工藝條件及配方為：發酵時間為18 d，發酵溫度為29 ℃，沙蟹添加量為1000 g，植物乳桿菌和魯氏酵母菌的最佳混合濃度比例為4∶5，接種量為26 mL，辣椒為360 g，鹽為340 g，在此工藝及配方條件下制備的鮮辣沙蟹汁感官評分為94.12，氨基酸態氮含量為8.89 mg/mL。

通過對比分析傳統發酵法與微生物發酵法制備鮮辣沙蟹汁的感官評價和理化指標，結果表明，微生物發酵法與傳統發酵法制備的鮮辣沙蟹汁相比，感官評分增加了6.53%，氨基酸態氮含量增加了9.48%，揮發性鹽基氮含量下降了22.22%，游離氨基酸總量增加了12.98%，鮮味與甜味氨基酸含量增加了44.09%。綜合分析，微生物發酵法通過添加植物乳桿菌和魯氏酵母菌顯著提高了傳統鮮辣沙蟹汁的風味品質，研究成果對于鮮辣沙蟹汁的工業化生產具有重要的實際意義，也為相關研究提供了參考依據。