響應面法優化大豆分離蛋白提取及復合酶解制備活性肽

孫會剛，陳志軒，周中馳，李凡松，王繼良，張傳麗，陳學紅，李同祥*

(1.徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018;2.廊坊農林科學院，河北 廊坊 065000)

大豆蛋白活性肽不但可以為人體提供大豆所能提供的營養成分，而且由于其自身特有的各種功能特性被廣泛應用于食品工業與醫療領域[1]。目前而言，美國和日本在大豆蛋白活性肽研究方面遙遙領先世界其他國家，他們使用大豆蛋白活性肽作為原料用于生產幼兒食品、面包、飲料、運動員專用食品等多種食品。大豆活性肽在國外也常常作為功能保健食品的主要配料使用[2]。盡管我國大豆資源豐富，但是，我國的技術工藝不夠成熟，所以目前對大豆蛋白活性肽的研究探索始終處于初級開發應用階段。雖然也取得了一些成效，大豆蛋白活性肽也可以進行工業化大規模的生產，但是市場上的大豆蛋白活性肽產品還較少，根本不能滿足不斷增加的市場需求量，更無法與美、日兩國媲美[3]。

利用大豆分離蛋白制備活性肽，首先要獲得較高大豆蛋白的提取率，目前報道的大豆分離蛋白提取方法主要有酶解酸沉法[4]、膜分離法[5-7]及堿提酸沉法[8-9]等。但在大豆深加工領域，由于成本低、技術水平要求低等優點，應用最多的仍然是堿提酸沉法。對于大豆分離蛋白提取方法的優化已有相關報道，但多數采用單因素或者正交的方法對其進行優化，而且涉及的影響因素也不夠全面，本文采用響應曲面優化法對大豆分離蛋白提取的影響因素進行較全面的研究，有望更好地提高提取率。

為了獲得高抗菌活性的大豆肽，本研究對大豆分離蛋白的提取方法進行優化，采用復合酶酶解法獲得了高抗菌活性的大豆肽，為開發新型具有防腐保鮮及保健功能的食品添加劑提供了新的思路和資源。

1 材料與方法

1.1 材料

黃豆：來自廊坊農科院。

胰蛋白酶(豬胰)：購自上海源葉生物科技有限公司；糜蛋白酶：購自南京都萊生物技術有限公司；其余試劑：均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基

LB培養基：根據參考文獻[10]制作。

1.2.2 大豆分離蛋白的提取

取適量黃豆去雜、烘干、粉碎、過篩，加入無菌水，液料比為10∶1，用NaOH調節pH值為堿性，水浴加熱并攪拌，7000 r/min離心15 min去渣，重復3次，取上清；HCl調pH值為酸性，水浴加熱并攪拌，7000 r/min離心15 min去渣，重復3次，取上清，加水溶解沉淀，用透析袋透析大豆分離蛋白水溶液過夜，真空冷凍干燥獲得粗蛋白。

蛋白質提取率=提取的粗蛋白重量/原料大豆重量。

1.2.3 大豆分離蛋白提取的單因素優化

根據報道，大豆分離蛋白提取主要受堿提pH值、堿提時間、堿提溫度和酸沉pH的影響。因此，以大豆分離蛋白提取率為考察指標，分別考察堿提pH(8，9，10，11，12)、堿提時間(40，50，60，70，80 min)、堿提溫度(30，40，50，60，70 ℃)和酸沉pH(2.5，3.5，4.5，5.5，6.5)對大豆分離蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應面實驗優化大豆分離蛋白提取

在單因素實驗的基礎上，選取堿提時間、堿提溫度、堿提pH、酸沉pH 4個變量為響應因子，以大豆分離蛋白提取率為響應值，采用Design Expert 8.0軟件設計四因素三水平響應面實驗[11-12]。分析各自變量對大豆分離蛋白提取率的顯著性，建立數學模型，進行方差分析及回歸分析，確定堿提酸沉法提取大豆分離蛋白的最佳工藝參數。實驗因素水平設計見表1。

表1 響應面設計因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 大豆分離蛋白酶解實驗

取大豆分離粗蛋白2.0 g，加入無菌水60 mL攪拌溶解，90 ℃水浴10 min滅菌，溫度降到室溫后用 1 mol/L氫氧化鈉調節pH值為7.5，按4000 U/g加入酶，45 ℃水浴4 h，沸水浴20 min使酶滅活，7000 r/min離心15 min去沉淀，重復3次，上清液即為酶解液。復合酶解所用到的酶及其性質見表2。

表2 實驗所用酶的性質Table 2 The properties of the enzymes used in the test

1.2.6 活性肽抑菌實驗

用牛津杯法測定活性肽的抑菌活性[13]。

1.2.7 活性肽的抗氧化活性

采用比色法進行定量分析[14]。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白的提取優化

2.1.1 堿提pH值對大豆分離蛋白提取率的影響

實驗結果顯示：堿提pH值對大豆分離蛋白提取率有較明顯的影響，見圖1。

圖1 堿提pH對大豆分離蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of alkali extraction pH on extraction rate of soybean protein isolate

由圖1可知，當pH值為8～11時，大豆分離蛋白的提取率隨著pH值的升高而升高，pH值為11時提取率最高，為28.15%。繼續增加pH值，提取率反而會下降，且下降較明顯。提取率在pH 9～11之間變化幅度較小，所以響應面優化中堿提pH值的變量選取9，10，11。

2.1.2 堿提時間對大豆分離蛋白提取率的影響

圖2 堿提時間對大豆分離蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of alkali extraction time on extraction rate of soybean protein isolate

堿提時間對蛋白質的提取率有一定影響但不明顯，提取率數值變化幅度較小。由圖2可知在40～70 min時，提取率緩慢上升；超過70 min后，蛋白質提取率下降且下降幅度大，蛋白質在堿提70 min左右達到平衡狀態；超過70 min，則會浸出許多非蛋白質物質，影響所得蛋白質的純度，進而影響蛋白提取效率，而且蛋白質長時間處于堿性環境下自身質會水解變性，蛋白提取效率也會下降。響應面優化蛋白質堿提時間變量為50，60，70 min。

2.1.3 堿提溫度對大豆分離蛋白提取率的影響

堿提溫度對蛋白質的提取率有一定影響，且影響也明顯。由圖3可知，隨著溫度不斷上升，蛋白質提取率呈現先升后降的趨勢，在30～50 ℃范圍內，蛋白質分子運動速率不斷加快，大量蛋白質分子進入堿提液，蛋白質提取率從27.25%提高到28.25%。溫度超過50 ℃后，蛋白質提取率開始降低，70 ℃時提取率為27.65%。這是因為蛋白質在高溫下變性，從而打破分子表面側鏈基團與水分子相互作用力的平衡，堿提液的黏度增加，不利于蛋白質的溶出[15]。響應面優化蛋白質提取溫度選取40，50，60 ℃。

圖3 堿提溫度對大豆分離蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of alkali extraction temperature on extraction rate of soybean protein isolate

2.1.4 酸沉pH對大豆分離蛋白提取率的影響

酸沉pH對大豆分離蛋白提取率有一定影響。由圖4可知，大豆分離蛋白在其等電點pH 4.5附近提取率最大，這是因為此時大豆蛋白表面所攜帶的正、負電荷數量相差不大，呈電中性，蛋白質分子之間靜電斥力大大減弱，反而增強了與水分子之間的相互作用力，此時蛋白質分子會聚集沉淀。此外在強酸條件下，肽鍵會被破壞，導致多肽鏈縮短，蛋白質沉淀會逐漸消失，所以在pH為2.5時，酸沉無沉淀。響應面優化蛋白質酸沉pH變量為3.5，4.5，5.5。

圖4 酸沉pH對大豆分離蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of acid precipitation pH on extraction rate of soybean protein isolate

2.2 Box-Behnken實驗設計與結果

根據單因素實驗結果，通過響應面設計法中的Box-Behnken對大豆分離蛋白提取進行優化。在29個實驗組合條件下，設計方案和結果見表3。

表3 響應面實驗設計、預測值及結果Table 3 Response surface test design, predicted values and results

續 表

2.3 模型的建立與顯著性分析

采用Design Expert 8.0軟件可得響應值和被檢變量的邏輯關系。獲得大豆分離蛋白提取的二次多元回歸方程(Y)為：Y=28.32+2.55A+0.63B+0.17C-0.22D+0.4AB+0.18AC+0.36AD-0.33BC+0.11BD-0.075CD-1.61A2-1.57B2-0.32C2+6.67×10-3D2。

利用軟件進一步對模型進行分析以驗證其有效性，模型的方差分析和顯著性分析見表4。

表4 回歸方程方差分析和顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

由表4方差分析結果可知，在該實驗模型中，響應值的決定系數(R2)為98.38%，表明蛋白質提取率中有98.38%的變化可以使用該模型解釋。RAdj2=96.75%，表明大豆分離蛋白提取模型能在96.75%程度上解釋實驗結果，僅有3.25%不能用該模型表示。失擬項不顯著(P>0.05)，說明該模型擬合度較好。其中P值越小，則表明該變量對提取率的影響越大：A與B的P值小于0.0001，C與D的P值大于0.05，由此可知影響蛋白提取率的主要因素是堿提pH值與酸沉pH值，而堿提時間、堿提溫度對大豆分離蛋白提取的影響較小。

圖5 大豆分離蛋白影響因素三維響應曲面圖Fig.5 Three-dimensional response surface diagrams of influencing factors of soybean protein isolate

由圖5可知，隨著堿提溫度不斷上升、堿提時間增加，蛋白提取率都呈先升后降的趨勢且曲面變化幅度小，所以堿提溫度和堿提時間兩因素對蛋白提取率的影響很小。酸沉pH值不斷升高，蛋白提取率呈先升后降的趨勢且在蛋白質等電點附近達到最高點，曲面整體變化幅度非常大，表明酸沉pH對蛋白提取率的影響很大。堿提pH值曲面變化幅度類似酸沉pH值的變化幅度，又比堿提溫度、堿提時間的變化幅度略大。所以酸沉pH值與堿提pH值對黃豆中大豆分離蛋白提取率的影響最大，堿提溫度與堿提時間的影響最小。

由此模型預測出大豆分離蛋白的最佳提取條件(見表5)，理論上蛋白提取率可達29.65%，根據實際操作條件對此模型進行驗證(見表6)，進行3次平行試驗，實際蛋白提取率為29.25%，與預測值相差0.40%，因此該模型可以較準確地確定大豆分離蛋白的最佳提取工藝。大豆分離蛋白含量約為40%，有文獻報道提取率達到70%以上[16]，主要是因為提取率定義不同，文獻提取率的定義是：提取的蛋白/原料中蛋白的含量，本研究中提取率為提取的蛋白重量/原料重量，如換算成文獻報道的提取率，應該提取率也為75%左右。且文獻中大豆分離蛋白提取多為提取后離心沉淀產物，而本研究中大豆蛋白提取以后經透析純化后冷凍干燥獲得，相對蛋白純度更高。

表5 模型預測最佳提取條件

表6 實際測定最佳提取條件Table 6 The optimal extraction conditions of actual determination

2.4 復合酶解活性肽的抑菌活性

采用牛津杯法測定大豆分離蛋白活性肽的抑菌活性，結果顯示：用胰蛋白酶和糜蛋白酶單獨酶解制備的活性肽對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌均有抑菌活性，且活性大小差不多，而同時采用兩種酶復合酶解制備的活性肽抑菌活性比兩種酶單獨酶解制備的活性肽都要強，說明兩種酶復合酶解能制備活性更高的活性肽，見圖6。

圖6 3種酶解液抑菌活性對比Fig.6 Comparison of antibacterial activities of three hydrolysates

2.5 復合酶酶解活性肽的抗氧化活性

測定兩種酶單酶酶解活性肽和復合酶酶解活性肽結果顯示都有一定的抗氧化活性，且復合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性最高，對DPPH自由基的清除率達到30.4%，見表7。

表7 3種酶解活性肽抗氧化能力測定Table 7 The determination of antioxidant capacity of three enzymatic active peptides

目前關于大豆分離蛋白活性肽抗氧化活性的報道不少，如孫莉莉等[17]采用堿性蛋白酶制備大豆活性肽并研究了其抗氧化活性，其對超氧陰離子自由基的清除能力達到41.2%，但該抗菌肽是經過分離純化的，所以本研究復合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性高低還需要進一步深入詳細的比較研究才能確定。

3 結論

經單因素及響應面優化法確定大豆堿提酸沉法蛋白最佳提取工藝為堿提時間60 min、堿提溫度60 ℃、堿提pH值11.0、酸沉pH值5.0，最佳提取工藝提取大豆分離蛋白提取率為29.25%。采用胰蛋白酶、糜蛋白酶復合酶解法獲得對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌具有較高抑菌活性的大豆分離蛋白活性肽，且該活性肽對DPPH自由基的清除率達到37.5%，具有一定的抗氧化活性。該法制備的活性肽有望開發新型營養保健食品，或作為食品添加劑添加到其他食品中起到防腐保鮮和營養保健的功效，開發功能性食品。