鹽析輔助液液萃取-HPLC-MS/MS法檢測(cè)液態(tài)乳中13種雙酚類和烷基酚類物質(zhì)

姜 侃 張 慧 曹 慧 王 瑾 周學(xué)軍 厲小燕

(1. 浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全科學(xué)研究院，浙江 杭州 310018；2. 浙江科技學(xué)院，浙江 杭州 310023)

雙酚類物質(zhì)如雙酚A(BPA)、雙酚B(BPB)等和烷基酚類物質(zhì)如壬基酚(NP)等化合物，通常被用于聚碳酸酯環(huán)氧樹(shù)脂等的塑料容器生產(chǎn)中以提高材料的透明度、阻燃性和耐用性[1-2]。由于其具有類似雌激素的特性可干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)[3-4]，使人體出現(xiàn)生殖系統(tǒng)異常、性早熟[5]，甚至癌變[6]，2011年衛(wèi)生部等6部門(mén)發(fā)布了禁止在嬰幼兒奶瓶中使用雙酚A的公告，一些塑料制品開(kāi)始貼上“不含雙酚A”的標(biāo)簽。但雙酚A的替代物雙酚S(BPS)、BPB等，烷基酚及阻燃劑四溴雙酚A(TBBPA)等酚類物質(zhì)的使用，仍然存在諸多安全風(fēng)險(xiǎn)。

目前，常見(jiàn)的乳制品中酚類化合物的檢測(cè)方法有液相色譜法[7-8]、液相色譜—質(zhì)譜法[9-11]、氣相色譜—質(zhì)譜法[12]、高分辨質(zhì)譜法[13]、電化學(xué)法[14]、生物傳感器法[15]、酶聯(lián)免疫法[16]等。王力等[7]采用液相色譜法測(cè)定了嬰幼兒配方奶粉中的雙酚A；公丕學(xué)等[10]建立了嬰幼兒配方乳粉中雙酚 A 和壬基酚的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量方法；劉蕓等[13]采用高分辨率質(zhì)譜法檢測(cè)確證了乳粉及乳制品中的壬基酚和雙酚A含量。上述研究多是針對(duì)乳制品中雙酚A或壬基酚等某幾個(gè)酚類化合物的研究，而乳制品中酚類物質(zhì)的高通量檢測(cè)方法研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究擬采用鹽析輔助液液萃取，建立液態(tài)乳中13種酚類物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，旨在為食品安全監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、酸奶樣品：市售；

BPA標(biāo)準(zhǔn)品(CAS 80-05-7)：純度98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

BPB(CAS 77-40-7)、雙酚AP(BPAP，CAS 1571-75-1)標(biāo)準(zhǔn)品：純度98%，美國(guó)TRC公司；

BPS(CAS 80-09-1)、雙酚E(BPE，CAS 2081-08-5)、雙酚F(BPF，CAS 620-92-8)、4-正辛基酚(4-n-OP，CAS 1806-26-4)、4-正壬基酚(4-n-NP，CAS 104-40-5)、4-壬基酚(4-NP，CAS 84852-15-3)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，北京Bepure公司；

雙酚Z(BPZ，CAS 843-55-0)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

辛基酚(OP，CAS 27193-28-8)、四氯雙酚A(TCBPA，CAS 79-95-8)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，美國(guó)Accu Standard公司；

TBBPA(CAS 79-94-7)：純度99%，美國(guó)Chem Service公司；

乙腈、正己烷、甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC 20AD型，日本Shimadzu公司；

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：5500QTRAP型，美國(guó)AB SCIEX公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司；

電子天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

旋渦混合器：VORTEX2型，德國(guó)IKA公司；

離心機(jī)：2-16P型，德國(guó)SIGMR公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱量各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為1 g/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃貯存。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取1 g/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液于同一容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/L(BPS和TCBPA為0.2 mg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃貯存。

1.3.2 提取溶劑和鹽析試劑的選擇 以牛奶為基質(zhì)，分別采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈/甲醇(V乙腈∶V甲醇為1∶1)各5 mL，乙腈/正己烷(V乙腈∶V正己烷為1∶1)10 mL進(jìn)行提取，選擇適合的提取溶劑。并分別取0.2，0.4，0.6，0.8 g 氯化鈉(NaCl)進(jìn)行鹽用量?jī)?yōu)化選擇。

1.3.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取2 g液態(tài)乳制品于15 mL具塞離心管中，加入5 mL乙腈渦旋振蕩2 min，加入0.4 g氯化鈉，渦旋2 min至其溶解，8 000 r/min離心5 min，取乙腈溶液層待測(cè)。

1.3.4 儀器參數(shù)條件

(1) 色譜條件：Waters AtlantisTMT3色譜柱為2.1 mm×150 mm×3 μm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈—甲醇(V乙腈∶V甲醇為1∶1)溶液，流動(dòng)相B為水；梯度洗脫程序：0～1 min，20% A；1～4 min，20%～95% A，維持4 min；8～8.2 min，95%～20% A；8.2～10 min，20% A，總運(yùn)行時(shí)間10 min。

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源負(fù)離子(ESI-)模式；噴霧電壓-4 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣241 kPa；霧化氣壓力345 kPa；輔助加熱氣379 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。具體條件見(jiàn)表1。

表1 13種酚類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證 以牛奶為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，分別以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。

1.3.6 加標(biāo)回收率與精密度測(cè)定 選取牛奶和酸奶樣品，分別添加高、中、低3個(gè)水平的13種混標(biāo)溶液，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 使用Analyst Software軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Multi Quant 3.0.2軟件分析數(shù)據(jù)， Excel軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

選取乙腈、乙腈/正己烷、乙腈/甲醇、乙醇、甲醇作為提取溶劑，對(duì)牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)13種酚類物質(zhì)均有檢出，但是由于牛奶中水分含量較高，而提取溶劑乙腈、乙醇和甲醇均與水互溶，水性溶劑使得溶劑體積增大，降低了酚類物質(zhì)的回收率。因此，采用鹽析液液萃取法以使有機(jī)提取溶劑與水相分層，從而提高酚類物質(zhì)的提取效率。13種酚類物質(zhì)的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

1. BPS 2. BPF 3. BPE 4. BPA 5. BPB 6. BPAP 7. BPZ 8. TCBPA 9. TBBPA 10. OP 11. 4-NP 12. 4-n-OP 13. 4-n-NP

在不同提取溶劑萃取后的溶液中加入足量的氯化鈉進(jìn)行鹽析處理，只有含有乙腈的提取溶劑與水相出現(xiàn)了分層，經(jīng)測(cè)定目標(biāo)物回收率，乙腈、乙腈/正己烷均表現(xiàn)出較好的提取效率。牛奶成分復(fù)雜，含有的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，乙腈既可以沉淀蛋白質(zhì)又可以提取目標(biāo)物質(zhì)，而正己烷可以減少脂肪的影響。由圖2可知，采用乙腈、乙腈/正己烷提取后的各目標(biāo)物回收率無(wú)明顯變化，為減少有機(jī)溶劑用量、簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，選取乙腈作為乳制品中酚類化合物的提取溶劑。

圖2 提取溶劑的影響

2.2 鹽析試劑和用量的選擇

在目標(biāo)物提取過(guò)程中分別加入0.8 g的硫酸銨和氯化鈉，考察溶液的分層情況和酚類物質(zhì)的回收率。結(jié)果顯示，加入硫酸銨和氯化鈉的溶液均出現(xiàn)了有機(jī)相和水相的分層，但13種酚類物質(zhì)的回收率有所不同(見(jiàn)圖3)，當(dāng)以硫酸銨作為鹽析試劑時(shí)，雙酚類物質(zhì)的回收率較好，均達(dá)到80%以上；而烷基酚類物質(zhì)4-NP、4-n-NP、OP、4-n-OP的回收率偏低，均在80%以下。當(dāng)以氯化鈉為鹽析試劑時(shí)，各類物質(zhì)的回收率均較好。因此，選擇氯化鈉作為鹽析試劑。

圖3 無(wú)機(jī)鹽類型的影響

由圖4可知，當(dāng)氯化鈉用量為0.2～0.8 g時(shí)，樣品提取液均有分層，當(dāng)用量為0.4 g時(shí)，各物質(zhì)回收率明顯增加，當(dāng)用量為0.4～0.8 g時(shí)，各物質(zhì)回收率變化不大，說(shuō)明0.4 g氯化鈉即可滿足鹽析要求，此時(shí)乙腈分層且萃取效率較佳，目標(biāo)物回收率為82.4%～110.3%。因此，選擇氯化鈉用量為0.4 g。

圖4 NaCl用量的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)通常采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)，一般以斜率比值在0.8～1.2范圍內(nèi)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)[17]。試驗(yàn)以牛乳和酸奶為基質(zhì)時(shí)13種酚類物質(zhì)的斜率比值分別為0.38～1.09，0.39～1.22，說(shuō)明不同類型的液態(tài)乳均具有一定的基質(zhì)效應(yīng)。為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用乳制品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。

2.4 線性方程、檢出限與定量限

以空白基質(zhì)樣液中加入混標(biāo)溶液配置系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并考察13種化合物的線性。由表2可知，13種酚類化合物在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.992 5～0.999 1。

表2 酚類物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

由表3可知，牛奶中13種酚類物質(zhì)的回收率為81.5%～118.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.89%～12.30%(n=3)；酸奶中酚類物質(zhì)的回收率為80.8%～107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%～11.90%(n=3)，說(shuō)明試驗(yàn)方法適合液態(tài)乳制品樣品中雙酚類和烷基酚類化合物的分析測(cè)定。

表3 酚類物質(zhì)的回收率與精密度

2.6 樣品分析

采用所建方法對(duì)市售的15個(gè)純牛奶和酸奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，僅1個(gè)樣品檢出4-NP，含量為9.28 μg/kg；其他樣品均未檢出雙酚類和烷基酚類化合物。4-NP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物，試驗(yàn)檢出的樣品盡管數(shù)量少、含量低，但其檢出提醒了人們應(yīng)關(guān)注食品中烷基酚類物質(zhì)的污染風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

建立了鹽析輔助液液萃取、HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)液態(tài)乳中13種雙酚類和烷基酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，樣品采用乙腈提取，氯化鈉為鹽析助劑使乙腈分層，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、提取效率高。13種酚類物質(zhì)在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.99；在牛奶和酸奶中的加標(biāo)回收率分別為81.5%～118.1%，80.8%～107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.89%～12.30%，1.12%～11.90%；方法檢出限為0.15～0.75 μg/kg，定量限為0.5～2.5 μg/kg。采用該法對(duì)市售15批次液態(tài)乳樣品中的酚類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，1個(gè)樣品中檢出含有4-NP，含量為9.28 μg/kg。后續(xù)可研究包裝材料中酚類化合物向乳制品中的遷移規(guī)律，并可加強(qiáng)對(duì)不同貯藏或應(yīng)用條件下乳制品中酚類化合物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。