外周血Septin9 基因甲基化和血清CA199聯合檢測在結直腸癌篩查中的診斷價值*

穆劍強，高海鋒

1.云南新昆華醫院檢驗科，云南昆明 655600；2.陜西省寶雞市中心醫院檢驗科，陜西寶雞 721008

結直腸癌(CRC)是消化系統常見的惡性腫瘤，其發病率居惡性腫瘤的第3位，且發病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。但是，約80%的CRC患者被診斷時病情已發展至中晚期[3]，給患者帶來巨大的身心痛苦和經濟壓力。目前，CRC 篩檢手段種類繁多，且各有優劣，主要包括糞便潛血試驗(FOBT)、結直腸鏡檢查、病理活檢等。FOBT檢測結果不穩定，靈敏度及特異度都比較低；結直腸鏡是侵入性檢查，易造成腸穿孔、腸道感染等并發癥，不易被患者接受；病理活檢是確診CRC的金標準，但屬于有創操作，不易被患者采納，甚至有感染的風險，不適用于普查。研究表明，外周血中 Septin9 基因的甲基化檢測診斷CRC的準確性較高，是一種可靠的診斷指標[4-6]。因此，本研究將Septin9 基因甲基化與傳統標記物CA199進行聯合檢測，探討二者聯合檢測對CRC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年8月至2020年8月云南新昆華醫院收治的202例結直腸病變患者的病歷資料，以結直腸鏡病理診斷為金標準，確診CRC患者93例(CRC組)，其中男60例、女33例，年齡35～81歲、平均(60.72±14.24)歲；結直腸息肉患者109例(結直腸息肉組)，其中男72例、女37例，年齡33～83歲、平均(61.11±13.87)歲。同時選擇同期體檢健康者50例作為對照組，其中男35例、女15例，年齡35～80歲、平均(60.12±13.84)歲。各組研究對象年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。參與本研究的對象均自愿簽署知情同意書，研究方案經云南新昆華醫院倫理委員會批準后實施。

1.2方法

1.2.1標本采集 Septin9基因甲基化檢測標本的采集使用專用EDTA-K2抗凝管，抽取受試者外周靜脈血10 mL，離心后取3.5 mL血漿保存于-20 ℃冰箱待測。同時抽取受試者外周靜脈血3～5 mL于普通促凝管中，用于CA199的測定，離心后取上層血清保存于-20 ℃冰箱待測。

1.2.2項目檢測 Septin9基因甲基化檢測采用聚合酶鏈反應(PCR)熒光探針法，試劑盒由北京博爾誠科技有限公司提供。核酸提取采用Smart32核酸提取儀，核酸擴增使用DA7600型實時熒光定量PCR擴增儀，儀器由中山大學達安基因科技有限公司提供。提取及擴增程序嚴格按照試劑及儀器操作說明進行操作。CA199檢測試劑盒、質控品、校準品及Cobas 601全自動化學發光分析儀均由瑞士羅氏有限公司提供。

1.3結果判斷 結果判斷：擴增循環數(Ct)≤41.0且ACTB內參的Ct≤32.0時結果為陽性；Ct>41.0且ACTB內參的Ct≤32.0時結果為陰性；檢測結果滿足上述要求，且擴增曲線無異常時結果最終判為有效。CA199的正常參考區間為0～37.0 U/mL，>37.0 U/mL時判定為陽性，否則為陰性。

1.4CRC組治療 CRC患者分別采用手術治療和藥物化療，其中手術治療76例，藥物化療17例。

1.5觀察指標 比較CRC組治療前各組Septin9基因甲基化和血清CA199陽性情況，以及CRC組治療后Septin9基因甲基化和血清CA199陽性情況。

1.6統計學處理 采用SPSS 24.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線分析Septin9基因甲基化、CA199單項及聯合檢測對CRC的診斷性能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CRC組治療前各組Septin9基因甲基化和CA199陽性率的比較 CRC組治療前，CRC組、結直腸息肉組和對照組Septin9基因甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=118.35，P<0.001)；CRC組與結直腸息肉組Septin9基因甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=67.88，P<0.001)；CRC組與對照組Septin9基因甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=100.44，P<0.001)；結直腸息肉組與對照組Septin9基因甲基化陽性率比較，差異亦有統計學意義(χ2=18.378，P<0.001)。CRC組、結直腸息肉組和對照組CA199陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=84.61，P<0.001)；CRC組與結直腸息肉組CA199陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=48.795，P<0.001)；CRC組與對照組CA199陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=63.97，P<0.001)；結直腸息肉組與對照組CA199陽性率比較，差異亦有統計學意義(χ2=10.984，P<0.001)。見表1。

2.2Septin9基因甲基化和CA199對CRC診斷的性能比較 Septin9基因甲基化、CA199單項檢測及聯合檢測對CRC診斷的性能比較，見表2。聯合檢測的靈敏度、約登指數和AUC較單項檢測高(P<0.05)。

2.3CRC組治療后Septin9基因甲基化和CA199陽性率 經治療后，CRC組Septin9基因甲基化陽性率為33.33%(31/93)，CA199陽性率為32.26%(30/93)，與表1中治療前的Septin9基因甲基化(87.10%)和CA199(72.04%)陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。治療方式不同，治療后Septin9甲基化基因和CA199陽性的比例不一致，采用手術治療的76例患者中，治療后Septin9基因甲基化陽性率為22.37%(17/76)，CA199陽性率為31.58%(24/76)；采用藥物化療的17例患者中，治療后Septin9基因甲基化陽性率為82.35%(14/17)，CA199陽性率為35.29%(6/17)。

表1 各組Septin9基因甲基化、CA199陽性率的比較[n(%)]

表2 Septin9基因甲基化、CA199單項檢測及聯合檢測對CRC的診斷性能比較

3 討 論

CRC是臨床上最常見的消化系統惡性腫瘤之一，調查顯示，我國每年CRC新發病例超過25萬，死亡病例約14萬，均占世界同期CRC病例的20%[7]。CRC早期癥狀不明顯，不易被患者察覺，出現明顯癥狀的CRC患者到醫院就診時，其病情已經發展到中晚期，錯過最佳治療時期，手術5年存活率僅30%～50%[8]。因此，高效的CRC篩查方法可以顯著改善患者5年生存率，降低病死率[9]。目前，診斷CRC的方法較多，包括FOBT、常規血清腫瘤標記物篩查、結直腸鏡檢查、病理活檢等，但這些方法靈敏度、特異度較低或為有創檢查，不能滿足CRC早期診斷和篩查的需求。研究顯示，異常DNA 甲基化和蛋白修飾異常引起致癌基因過度表達、抑癌基因表達缺失是CRC發生與發展的重要機制，其中 Septin9 基因甲基化被認為與CRC密切相關[10]。因此，本研究將Septin9基因甲基化和傳統腫瘤標記物CA199納入研究，探討二者聯合檢測在CRC篩查中的應用價值。

Septin9基因屬于抑癌基因，其甲基化會抑制該基因正常表達，導致細胞分裂異常和癌變，其參與CRC癌變的機制主要包括缺氧誘導因子(HIF)-1信號通路、JNK信號通路、Rho信號通路以及通過影響細胞正常分裂誘導多核細胞產生[11]。在CRC患者體內，由于腫瘤細胞凋亡及壞死，其DNA被釋放入外周血，因此在外周血中可檢測到異常甲基化的Septin9[12]。本研究結果顯示，CRC組外周血Septin9基因甲基化陽性率明顯高于結直腸息肉組和對照組(P<0.05)，結直腸息肉組Septin9基因甲基化陽性率顯著高于對照組(P<0.05)，表明Septin9基因甲基化在CRC患者中高表達，外周血Septin9基因甲基化檢測對診斷CRC具有較好的臨床價值。CRC組血清CA199陽性率顯著高于結直腸息肉組和對照組，但均較Septin9基因甲基化陽性率低。

本研究進一步對CRC組中Septin9基因甲基化和CA199單項檢測和聯合檢測診斷CRC的性能做了研究，結果顯示Septin9基因甲基化診斷CRC的靈敏度為89.32%，較文獻[13-14]報道的Septin9基因甲基化檢測篩查CRC的靈敏度高，這可能與本研究收集的病例數較少、患者就診時間點的選擇等因素有關。Septin9基因甲基化診斷的約登指數為0.681 1，AUC為0.793，均高于CA199檢測的結果，表明Septin9基因甲基化對診斷CRC具有很高的靈敏度和準確度，可成為CRC患者篩查或診斷的實驗室指標。血清CA199檢測的靈敏度較外周血Septin9基因甲基化低，但特異度較外周血Septin9基因甲基化高，所以可以彌補Septin9基因甲基化診斷中的不足。最后，本研究將兩項指標聯合進行分析，結果顯示，二者聯合檢測的靈敏度、約登指數和AUC均較單項檢測高，表明聯合檢測較單一指標檢測更有優勢。通過這種無創的檢測方法可以快速地將高危人群篩查出來，進而再對高危人群做進一步的病理組織檢查，最大限度地減少有創檢查的比例，提高患者依從性，縮短檢測周期，節省醫療資源。

最后，本研究將CRC組治療前后Septin9基因甲基化和CA199陽性率做了統計研究，結果發現，CRC組Septin9基因甲基化和CA199治療前后陽性率的比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明兩項指標對于評估CRC患者治療后效果具有一定的臨床價值。隨后，本研究對采用不同治療方式的患者做了統計，結果顯示：采用手術治療的76例患者中，治療后Septin9基因甲基化陽性率為22.37%，CA199陽性率為31.58%；采用藥物化療的17例患者中，治療后Septin9基因甲基化陽性率為82.35%，CA199陽性率為35.29%。這就表明，Septin9基因甲基化檢測在手術后的患者中改變明顯。CA199對于手術治療的CRC患者的預后評估價值雖然不及Septin9基因甲基化，但其在藥物化療評估中的變化較采用手術治療更明顯。

綜上所述，Septin9基因甲基化和CA199檢測具有簡便、快速、準確、患者易接受及適用于普查等優點，二者聯合檢測可以做到優勢互補，提高診斷效率，對于CRC的診斷和預后評估具有很高的價值。由于本研究樣本量較少，對于外周血Septin9基因甲基化在CRC分期中的診斷價值未做進一步研究，將繼續積累病例，將Septin9基因甲基化水平與CRC分期的相關性探索納入今后的研究中，為CRC分期的診斷提供更可靠的科學依據。