血清miR-224、miR-29c表達在ST段抬高型心肌梗死患者預后評估中的價值

董曜瑋，李世權，李亞坤，李書輝

河南省鄭州陽城醫院心血管內科，河南鄭州 452470

急性冠脈綜合征(ACS)是臨床較為常見的心血管疾病，多因冠狀動脈阻塞而引起，而不穩定性斑塊破裂或糜爛則導致血栓形成，因此增加斑塊穩定性可降低心血管疾病發生風險[1]。ST段抬高型心肌梗死(STEMI)是一類具有典型缺血性胸痛的急性心肌梗死，經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是臨床治療STEMI的有效手段，臨床應用廣泛，但仍有部分患者經PCI治療后發生不良心血管事件(MACE)，這已成為困擾臨床工作者的難題。微小RNA(miRNAs)對真核細胞的基因表達以及細胞發育等多方面有調控作用[2]。微小RNA-224(miR-224)在多種腫瘤中呈異常表達，有研究表明，miR-224可靶向調控前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)，影響脂質代謝，從而參與動脈粥樣硬化進程[3]。微小RNA-29c(miR-29c)在多種疾病中呈異常表達，其可能參與調節斑塊的穩定性[4]。但是目前臨床關于miR-29c、miR-224與STEMI預后的關系尚不明確，因此本研究重點探討miR-29c、miR-224對STEMI患者預后的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2019年12月于本院就診的STEMI且行PCI治療的患者222例為研究對象，其中男127例、女95例，年齡55～82歲、平均年齡(64.80±8.69)歲。納入標準：(1)首次發病并確診為STEMI；(2)均行PCI治療；(3)發病到入院時間在24 h內；(4)患者臨床資料完整，可堅持定期隨訪。排除標準：(1)合并有慢性、急性感染；(2)存在心肌梗死既往發病史或繼發性STEMI；(3)合并有結締組織疾病或惡性腫瘤、血液系統疾病；(4)需長期使用免疫抑制劑相關藥物。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意。所有患者均隨訪12個月，并根據隨訪期間是否發生主要MACE分為MACE組和未發生MACE組。

1.2方法

1.2.1一般資料及實驗室指標收集 收集并記錄各組患者性別、年齡、體質量指數(BMI)、病史及術后用藥情況，同時采用日立7600全自動生化儀檢測患者血脂指標，包括三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。其中TG、LDL-C根據《中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》中標準分為高、低水平，TG≥1.7 mmol/L為高水平，LDL-C≥3.4 mmol/L為高水平，反之則為低水平[5]。采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測患者心功能指標[左室射血分數(LVEF)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室舒張末期容積(LVEDV)]；采用Philips H 5000F型心血管造影儀以Judkins法經橈動脈進行冠狀動脈造影檢查，采用Gensini評分系統[6]評估STEMI患者冠狀動脈病變程度。

1.2.2血清miR-224、miR-29c檢測 所有患者均在入院24 h內空腹抽取靜脈血5 mL，離心機下以3 000 r/min轉速離心10 min，提取上清液保存于-80 ℃待測。血清miR-224、miR-29c均采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測。首先在無菌環境中采用Trizol法提取血清中RNA(試劑盒購自日本TaKaRa公司)，然后在Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀中反轉錄為cDNA，反轉錄反應條件為16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。并采用qRT-PCR儀對miR-224、miR-29c以及內參U6進行擴增反應，引物由武漢博士德生物工程有限公司合成。miR-224上游引物5′-ACATCTACGACGTAGAGATG-3′，下游引物5′-GT ATACTTGCTATCCACG-3′；miR-29c上游引物5′-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3′，下游引物5′-TTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。擴增反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s 循環45次。最后采用2-ΔΔCt法計算血清miR-224、miR-29c的相對表達水平。實驗過程中嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3隨訪 隨訪時間從患者術后第1天開始計算，隨訪期為12個月，患者均行常規冠狀動脈造影復查，每3個月定期檢查一次，或自愿復查，或患者由于再次胸痛、胸悶等癥狀復查。以STEMI患者出現MACE為終點事件，包括嚴重心律失常、非致死性心肌梗死、非計劃再次血運重建、全因死亡及心源性死亡等，隨訪終點以出現終點事件或隨訪12個月為止。以MACE作為評估患者預后的指標，根據患者第1次出現MACE的時間計算無進展生存期。

2 結 果

2.1一般資料比較 222例行PCI治療的STEMI患者均進行12個月隨訪，52例(23.42%)患者發生MACE。MACE組的TG、LDL-C水平顯著高于非MACE組(P<0.05)，LVEF顯著低于非MACE組(P<0.05)，表1中其他各項指標兩組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 MACE組和非MACE組患者一般資料比較[n(%)或

2.2miR-224、miR-29c水平比較 MACE組血清miR-224、miR-29c水平明顯低于非MACE組(P<0.05)，見表2。

2.3血清miR-224、miR-29c水平與STEMI患者預后情況的關聯分析 miR-224高水平患者在隨訪12個月內MACE發生率為14.41%，無進展生存期均值為11.450個月(95%CI：11.162～11.739)；miR-224低水平MACE發生率為32.43%，無進展生存期均值為10.847個月(95%CI：10.466～11.227)。miR-224高水平患者和miR-224低水平患者的生存曲線不同，miR-224高水平患者的無進展生存率高于miR-224低水平患者(Log-rank檢驗χ2=9.749，P=0.002),見圖1。miR-29c高水平患者在隨訪12個月內MACE發生率為11.71%，無進展生存期均值為11.495個月(95%CI：11.215～11.776)；miR-29c低水平患者MACE發生率為35.14%，無進展生存期均值為10.802個月(95%CI：10.418～11.186)。miR-29c高水平患者和miR-29c低水平患者的生存曲線不同，miR-29c高水平患者的無進展生存率高于miR-29c低水平患者(Log-rank檢驗χ2=15.933，P<0.001)，見圖2。

表2 兩組血清miR-224、miR-29c水平比較

圖1miR-224與STEMI患者預后發生MACE的K-M曲線

2.4STEMI患者預后的危險因素分析 以STEMI患者是否發生MACE(是為1，否為0)作為因變量，以表1、2中差異有統計學意義的LVEF、TG、LDL-C、miR-224、miR-29c為自變量進行COX回歸分析，依據各值平均數分為高、低水平。將高LVEF、TG低水平、LDL-C低水平、miR-224高水平、miR-29c高水平均賦值為0，反之為1。結果顯示，低LVEF、LDL-C高水平、miR-224低水平、miR-29c低水平均是STEMI患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

圖2 miR-29c與STEMI患者預后發生MACE的K-M曲線

表3 多因素分析結果

3 討 論

近年來STEMI發病率及病死率呈逐年上升趨勢，臨床特征表現為發病急、病情變化速度快、預后差等，由于動脈粥樣硬化斑塊破裂使血小板黏附、聚集，形成血栓，進而致冠狀動脈阻塞，不僅是STEMI發病原因，也是導致患者死亡的重要原因之一，尋找快速、有效評估STEMI病情的生物標志物以改善患者預后成為當前研究重點[7]。研究顯示，斑塊穩定性受多種因素影響，新生血管結構、功能及數量均影響斑塊穩定性，結構異常的新生血管顯著促進斑塊進展[8-9]。本研究222例STEMI患者在12個月隨訪期內，有52例患者發生MACE，發生率為23.42%，可見部分患者存在不良結局，威脅患者生命健康。

miRNAs在真核生物中廣泛存在，僅占人類基因組1%～3%，卻參與調控1/3基因的表達。miRNAs具有抗酸堿、抗凍融處理及抗RNA酶的特點，在血清中能夠相對穩定地存在，加上血液標本獲取便捷，使研究血清中miRNAs的水平具有可行性[5]。miR-224定位于X染色體，在宮頸癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中異常表達，在不同的腫瘤中發揮促癌或抑癌作用，同時關于其與動脈粥樣硬化的關系已成為研究熱點[10-11]。miR-29c定位于1q32.2染色體，在肺癌[12]、胰腺癌[13]、糖尿病腎病[14]等多種疾病中表達異常。有研究表明，miR-29c通過調控靶基因ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ等表達，促進細胞外基質表達并在內皮細胞外堆積，進而影響斑塊穩定性[5]。本研究發現，MACE組與非MACE組相比，LVEF、miR-224、miR-29c水平均較低(P<0.05)，TG、LDL-C水平均較高(P<0.05)，提示LVEF、miR-224、miR-29c、TG、LDL-C可能與STEMI患者預后狀況密切相關。推測原因是Kexin樣前轉化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第9個成員(PCSK9)可與低密度脂蛋白受體結合促進其進入溶酶體而發生降解，進而使低密度脂蛋白受體介導的膽固醇清除減少，血漿脂質增加，最終影響斑塊穩定性，增加心血管疾病發生風險，而miR-224可靶向抑制PCSK9表達；因此，低表達的miR-224對STEMI病情產生促進作用[3-4,11]。miR-29c可能通過調控細胞外基質表達及新生血管形成，影響斑塊穩定性，進而參與STEMI。K-M曲線結果顯示，miR-224、miR-29c高水平均提示患者具有較好預后。另經COX回歸模型分析顯示，低LVEF、LDL-C高水平、miR-224低水平、miR-29c低水平均是STEMI患者預后的獨立危險因素，表明miR-224、miR-29c可能成為預測STEMI患者預后的指標之一，同時也提示對于低LVEF、LDL-C高水平的STEMI患者應密切關注，進行有效干預可預防MACE的發生。

綜上所述，血清miR-224低水平、miR-29c低水平是STEMI患者預后的獨立危險因素，推測二者可能成為預測STEMI患者預后的潛在指標。但本研究為單中心、小樣本量研究，可能造成結果偏差，值得后續擴大樣本量或進行多中心病例對照研究以論證該結果。