不同HPLC-MS/MS法檢測骨髓移植患者雷帕霉素血藥濃度的相關性及意義*

王 磊，盧光澤，孫文利，劉紅星,2,3△

1.河北燕達陸道培醫院檢驗科，河北廊坊 065201；2.北京陸道培醫院，北京100176；3.北京陸道培血液病研究院，北京 100176

雷帕霉素(RAP)作為大環內酯類免疫抑制劑，可減少骨髓移植后急性排斥反應和耐激素排斥反應的發生，亦可通過抑制mTOR激酶活性進而抑制腫瘤細胞生長，還兼具低腎臟毒性和糖代謝保護作用等優點[1-2]。而RAP血藥濃度過低易發生急性排斥反應，濃度過高又可導致血小板減少、白細胞減少等不良反應[3]。1995年，YATSCOFF等[4]就指出應監測RAP血藥濃度，且推薦采用色譜法作為RAP血藥濃度檢測的標準方法；2001年，MAHALATI等[5]又指出RAP血藥濃度檢測可選用高效液相色譜法(紫外檢測器)或質譜法；2005年，STENTON等[6]推薦了RAP血藥濃度監測頻率和范圍，進一步推動了RAP血藥濃度檢測在臨床的廣泛應用。目前，用于RAP血藥濃度檢測的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法有采用同系物子囊霉素作內標，亦有采用RAP穩定同位素(RAP-d3)作內標。本研究團隊前期亦建立了以子囊霉素為內標的HPLC-MS/MS法用于RAP血藥濃度測定[7]。由于RAP-d3色譜性能更接近于RAP，為更好地避免基質效應及儀器等對RAP血藥濃度測定的影響，本研究特建立以同位素RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法，同時對兩種內標的HPLC-MS/MS法檢測結果進行分析，以確定哪種內標的HPLC-MS/MS法更適合用于骨髓移植患者的RAP血藥濃度測定。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年10月至2021年2月送河北燕達陸道培醫院藥理室檢測RAP血藥濃度的骨髓移植患者新鮮剩余全血標本，共173份。要求血標本無黃疸、無乳糜、無溶血及凝血，剩余全血量不小于1 mL。

1.2儀器與試劑 采用4000 Q TRAP質譜儀(美國AB Sciex公司)，島津 20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，AnalystV1.5.2 工作站(美國 AB 公司)，渦旋振蕩器(其林貝爾)，微量臺式低溫離心機(Thermo Fisher)。 RAP校準品和質控品為ClinCal?-Calibrator(RECIPE CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)和ClinChek?-Control(RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)；RAP-d3(HPLC Grade，Toronto Research)。其余試劑及儀器詳見本研究團隊前期研究[7]。

1.3方法 分別采用內標為RAP-d3和子囊霉素的HPLC-MS/MS法同時對173份標本進行RAP血藥濃度檢測。RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法測定RAP血藥濃度的參數：RAP-d3質子數/電荷數(m/z)為934.6>864.6，其余質譜參數、色譜系統參數及性能驗證方法同以子囊霉素為內標的HPLC-MS/MS法[7]。殘留結果驗證需符合FDA方法學驗證的指導原則[8-9]。根據STENTON等[6]在2005年推薦的RAP血藥濃度監測范圍，并結合河北燕達陸道培醫院實際監測情況，把兩種HPLC-MS/MS法檢測RAP血藥濃度結果分成<4、4～10、>10 ng/mL。

1.4統計學處理 使用SPSS 22.0 對兩種方法檢測173份標本RAP血藥濃度的結果通過配對t檢驗進行差異分析，以P<0.05為差異有統計學意義；同時對兩種方法檢測結果進行相關性分析，并把兩種方法檢測結果分布情況繪制成山巒圖，以觀察其數據分布及對比兩種HPLC-MS/MS法檢測結果的一致性。

2 結 果

2.1以RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法性能驗證結果 通過對3條標準曲線進行擬合，計算線性回歸的相關系數(r)。方法確證曲線為Y=0.126X+0.064 3，r2=0.998 8，結果表明，RAP血藥濃度在0～54.9 ng/mL線性關系良好。RAP出峰保留時間為1.73 min，內標RAP-d3保留時間為1.73 min，二者峰高比恒定，確定RAP-d3作為RAP的內標較為合適。同時亦表明，全血中的基質對RAP及內標RAP-d3的測定不產生干擾，專屬性較好，內標歸一化的基質因子在0.90～1.00，基質效應對最終結果影響較小。RAP日內CV為2.28%～2.89%，回收率為98.52%～104.61%；日間CV為2.37%～3.39%，回收率為97.04%～103.52%；二者CV均小于4%，回收率位于98%～105%，回收率高。穩定性實驗所測得結果回收率為100%～110%，CV均小于5%。殘留結果驗證：空白標本的峰面積小于最低定量下限峰面積的20%，內標殘留結果為0，符合FDA方法學驗證的指導原則。

2.2差異分析 以子囊霉素為內標的HPLC-MS/MS法和以RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法檢測173例骨髓移植患者RAP血藥濃度結果，兩種方法檢測結果數據均符合正態分布，其均值分別為4.16 ng/mL和4.30 ng/mL，差異無統計學意義(t=2.127，P=0.35>0.05)。

2.3相關性分析 根據兩種HPLC-MS/MS法檢測結果繪制散點圖，以子囊霉素為內標的HPLC-MS/MS法測定結果為自變量X，以RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法測定結果為函數Y，進行線性回歸，回歸方程為Y=0.932X+0.158，兩種HPLC-MS/MS法檢測結果相關性較好(r2=0.915)。見圖1。

圖1 兩種HPLC-MS/MS法檢測結果相關性分析

注：1組為<4 ng/mL；2組為4～10 ng/mL；3組為>10 ng/mL。

2.4一致性分析 HPLC-MS/MS(RAP-d3)方法檢測RAP血藥濃度，173份標本中，RAP血藥濃度<4 ng/mL的占50.87%，4～10 ng/mL的占44.55%，>10 ng/mL的占4.58%。HPLC-MS/MS(子囊霉素)方法檢測RAP血藥濃度，173份標本中，RAP血藥濃度<4 ng/mL的占54.91%，4～10 ng/mL的占42.20%，>10 ng/mL的占2.89%。兩種HPLC-MS/MS法檢測結果主要集中于<4 ng/mL和4～10 ng/mL兩部分，兩種檢測方法這兩部分結果基本重疊，一致性較好，而>10 ng/mL數據比較分散，一致性較差，說明兩種方法在檢測高RAP血藥濃度時可能存在差異。見圖2。

3 討 論

骨髓移植作為可能根治惡性血液病的一種有效治療手段，其移植后的移植物抗宿主病(GVHD)是影響移植物存活和患者生存質量的主要原因[10]。而RAP作為一種強效、低毒的免疫抑制劑，往往與環孢素或其他低效的免疫抑制劑聯用于GVHD的預防和治療[11]。但RAP像其他免疫抑制劑一樣，具有治療窗窄、個體差異大等特點，須在用藥的過程中進行血藥濃度監測，避免不良反應，提高移植成功率。

目前RAP血藥濃度檢測方法主要有色譜法和HPLC-MS/MS法，內標的選擇多為子囊霉素和同位素RAP-d3，鮮見關于此兩種不同內標對HPLC-MS/MS法檢測結果影響的報道。本研究建立的以RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法特異性強，重現性好，能準確、靈敏、快速地檢測骨髓移植患者全血RAP濃度。子囊霉素是一種RAP的乙基類似物，結構上與RAP相似[12]；而RAP-d3擁有與RAP相同的物理化學性質，其離子化效率和分離度幾乎一樣，可以最大限度消除分析方法的誤差。就兩者理化結構和化學性質進行比較，穩定性同位素為理想內標首選，而我國2015版《中華人民共和國藥典》對生物樣品定量分析中使用同位素內標也有相關規定：當在生物分析方法中使用質譜檢測時，推薦盡可能使用穩定同位素標記的內標[8]。穩定性同位素作為內標使用后，由于待測組分與內標是同一種物質，兩者離子豐度比相同，誤判率極小，可以進一步確證化合物，所以，當兩種內標法所測結果不一致時，推薦以穩定同位素內標法所測結果為準。

根據國內RAP臨床試驗結果,建議RAP全血谷濃度術后0～3個月控制在5～10 ng/mL，術后4～6個月控制在3～8 ng/mL，而本次試驗隨機選取173份骨髓移植患者的全血中RAP濃度(RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法)≤10 ng/mL占95.42%，說明河北燕達陸道培醫院對RAP濃度控制較為理想[13]。進一步對173份全血RAP血藥濃度結果分析可看出，以RAP-d3為內標的HPLC-MS/MS法檢測結果與以子囊霉素為內標的HPLC-MS/MS法檢測結果相關性較好，結果差異小，但是對于RAP血藥濃度>10 ng/mL的患者標本而言，兩種方法一致性較差，可能存在差別。究其原因，可能跟子囊霉素為RAP的結構類似物，其物理化學性質與RAP存在細微差別，導致其色譜行為不一致有關；而RAP-d3作為RAP的同位素，其物理化學性質和色譜學行為與RAP一致性更好，受儀器狀態和前處理環節影響更小，結果相對更可靠。在針對RAP血藥濃度監測內標的選擇上，本研究選擇的為氘代內標，可能不如13C內標的檢測效果，后期本研究團隊會繼續對氘代內標和13C內標的選擇做進一步研究，以期為臨床RAP血藥濃度測定內標的選擇提供參考，讓檢測結果更可靠。