無菌體液中耐碳青霉烯腸桿菌科細菌的臨床分布及耐藥性分析*

張鴻娟，孟雪斐，馬志剛，單 斌△

1.昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，云南昆明 650032；2.云南省醫學檢驗臨床研究中心，云南昆明 650032；3.云南省檢驗醫學重點實驗室，云南昆明 650032

細菌耐藥已成為全球公共健康領域的重大挑戰，其中尤以耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)引起的感染形勢最為嚴峻。CRE菌株所致感染具有高病死率、高耐藥性、高傳播性的特點[1]。根據美國疾病預防控制中心對CRE的定義，滿足以下任意一個條件的腸桿菌科細菌即定義為CRE：(1)對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者，對于天然對亞胺培南敏感性降低的細菌(如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等)，需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果；(2)產生碳青霉烯酶[2]。研究顯示，CRE所致侵襲性感染的病死率可達56.7%[3]。CRE菌株通常還攜帶有對其他抗菌藥物耐藥的基因，對抗菌藥物呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征，使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境。碳青霉烯酶耐藥基因大多數位于可移動基因元件上，導致其很容易在不同腸桿菌科細菌以及其他革蘭陰性桿菌間轉移，在短時間內可導致大范圍的流行播散[4]。2019年全國細菌耐藥監測網(CARSS)數據顯示，全國1 429所醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為10.9%，部分省市甚至超過20%[5]。本研究旨在分析昆明醫科大學第一附屬醫院無菌體液(含全血、腦脊液、胸腔積液、腹水、無菌部位引流液)中檢出的CRE分布及耐藥特點，以期為臨床合理使用抗菌藥物提供依據，改善患者結局，減輕患者疾病負擔。

1 資料和方法

1.1菌株來源 菌株來源于昆明醫科大學第一附屬醫院2020年1月至2021年2月臨床無菌部位標本經培養瓶培養，藥敏結果為亞胺培南或美羅培南耐藥的腸桿菌科細菌，依據保留同一患者相同細菌第一株的原則剔除重復菌株后納入最終分析。

1.2儀器和設備 美國BD全自動微生物培養系統 Bactec Fx200，英國BAKER生物安全柜，法國生物梅里埃公司微生物鑒定及藥敏分析系統，法國生物梅里埃公司全自動平板接種儀，美國THERMO CO2培養箱，美國GE凝膠電泳圖像分析儀(Image Quant LAS 500)，天隆科技基因擴增熱循環儀，PowerPac3000型電泳儀。

1.3質量控制 全自動微生物分析儀和藥敏紙片擴散法均按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)要求進行質量控制。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC49134、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌ATCC700323、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎鏈球菌ATCC49619、糞腸球菌ATCC29212、屎腸球菌ATCC35667，每周進行一次質控。采用正確的消毒方法及由受過培訓的專業人員按照標準操作程序進行無菌體液標本的采集，以保證檢驗前質量。

1.4方法

1.4.1細菌鑒定及藥敏試驗 參照《血培養檢測規范化操作》進行標本的正確采集并將其快速置于全自動微生物培養系統。儀器報警有陽性瓶時，取出陽性培養瓶充分顛倒混勻，涂片進行革蘭染色鏡檢，同時用1 mL無菌注射器抽取瓶內適量培養液，常規轉種血瓊脂平板、麥康凱平板，每個平板3～5滴4區劃線，腦脊液標本加種巧克力平板和沙保羅瓊脂平板，置35 ℃、5% CO2培養箱培養18～24 h。根據菌落形態特點，作初步判斷，然后使用法國生物梅里埃公司微生物鑒定及藥敏分析系統進行藥敏試驗。藥敏試驗結果參照CLSI標準進行結果判讀，發現非敏感菌株即進行表型確證試驗。

1.4.2表型確證試驗 采用改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)進行表型確證試驗。取1 μL接種環滿環生長于瓊脂平板上的過夜培養純菌落，于2 mL TSB肉湯中，振蕩混勻10～15 s。每管放入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中。(35±2)℃大氣環境孵育(4±0.25)h。孵育結束時，立即用生理鹽水制備0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC 25922菌懸液。菌懸液制備和平板涂布必須在15 min內完成，干燥3～10 min。用10 μL接種環將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，將紙片貼于試管內壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MHA平板上。100 mm的MHA平板最多貼4張紙片，150 mm的MHA平板最多貼8張紙片；倒置平板，(35±2)℃大氣環境孵育18～24 h；測量抑菌圈直徑。美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm，或直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落，判讀為碳青霉烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19 mm，判讀為碳青霉烯酶陰性；抑菌圈直徑為16～18 mm，或直徑為≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落，判讀為碳青霉烯酶不確定。

1.4.3PCR擴增CRE菌株的耐藥基因 煮沸法裂解提取細菌DNA，擴增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、blaIMP、blaVIM。PCR反應體系(50 μL)：RNase/DNase-free水15.0 μL,BlasTaq 2×PCR MasterMIX 25.0 μL，模板4.0 μL,引物F 2.0 μL,引物R 2.0 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)30 s,72 ℃延伸30 s(30個循環)；72 ℃延伸5 min。引物序列及退火溫度見表1。引物由北京擎科生物有限公司合成，2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳時間30 min。電泳結果顯示陽性的擴增產物送北京擎科生物有限公司進行測序分析。測序結果與NCBI數據庫進行比對。

表1 PCR擴增引物及退火溫度

1.5統計學處理 采用WHONET5.6和SPSS22.0進行結果處理和分析，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者基本情況與菌株分類 從無菌體液中分離鑒定出46株CRE。46株CRE菌株來源的患者中男40例，女6例；年齡為17～90歲，中位數為50歲；住院天數為4～93 d，中位數為31 d;患者30 d病死率為32.6%(15/46)。46株CRE菌株共分布于5種標本，其中引流液來源于無菌部位，為胰腺引流液及膽管引流液(表2)；共來源于10個科室，其中急診監護室占37.0%，重癥醫學科占30.4%(表3)。

表2 無菌體液中CRE菌株分布情況

2.2細菌種類分布 46株CRE菌株中肺炎克雷伯菌43株，大腸埃希菌1株，產氣克雷伯菌1株，陰溝腸桿菌1株。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中檢出攜帶blaKPC基因 32株、blaOXA-48基因7株、blaIMP基因 1株，檢出同時攜帶blaKPC、blaOXA-48基因2株，檢出未攜帶blaKPC、blaOXA-48、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因的菌株1株。耐碳青霉烯類大腸埃希菌1株，耐藥基因為blaOXA-48。耐碳青霉烯類產氣克雷伯菌1株，耐藥基因為blaOXA-48。耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌1株，耐藥基因為blaNDM。

表3 無菌體液中CRE菌株來源科室的分布情況

2.3藥敏試驗結果 46株無菌體液中分離的CRE除對碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南或美羅培南)耐藥外，對β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環內酯類、磷霉素等抗菌藥物普遍耐藥，未發現對替加環素耐藥的菌株(表4)。

表4 46株CRE菌株對常見抗菌藥物的藥敏試驗結果[n(%)]

續表4 46株CRE菌株對常見抗菌藥物的藥敏試驗結果[n(%)]

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物被認為是治療腸桿菌科細菌感染的最后一道防線[6]。隨著CRE的檢出率不斷升高，臨床抗感染治療面臨無藥可用的困境，患者及其家屬因疾病所遭受的痛苦和經濟負擔顯著增大。CRE引起的侵入感染，病死率高。有研究顯示，我國CRE血流感染30 d病死率為46.2%[7]。在血液病患者中，CRE導致的血流感染病死率甚至高達77.3%[8]。本研究中，無菌體液分離出CRE的患者30 d病死率為32.6%(15/46),低于文獻報道。這可能與本研究標本來源中包括胸腔積液、腹水及無菌部位引流液相關。有研究表明，醫療器械使用、侵入性醫療操作是醫院獲得性CRE的風險因素。呼吸機表面、氣管內套管是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌傳播的重要危險因素[9]。本研究中，所有患者均進行了侵入性操作，有的患者有2項以上的侵入性操作，同時患者普遍病情危重、年齡較大、常合并多種疾病、有外傷等，促使腸道、呼吸道和尿路定植的細菌發生感染。CRE定植導致CRE感染率高達16.5%，而且定植發展為感染的患者病死率更高[10]。有研究顯示，通過對入住ICU患者進行CRE的主動篩查，病房產碳青霉烯酶細菌的定植率從28.6%下降至5.6%，感染率從35.7%下降至2.8%[10]。因此，有條件的醫療機構宜結合自身特點、耐藥菌監測數據對特定人群進行CRE的主動篩查。

不同國家、不同地區、不同醫院、不同人群以及不同細菌所產的碳青霉烯酶種類均有差異[11]。我國臨床分離的CRE菌株產生的碳青霉烯酶以KPC、NDM和OXA-48型為主。中國細菌耐藥檢測網(CHINET)對2018年收集自全國39所醫院935株CRE菌株的研究結果顯示，產KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶的菌株所占比例分別為51.6%、35.7%和7.3%[12]。本研究中產OXA-48型碳青霉烯酶的菌株占23.9%(11/46)，與全國統計數據有差異，其原因一方面是由于本研究樣本數量較少，另一方面是由于地區差異。本研究標本來源醫院為省級三級甲等醫院，接收大量下級醫院的危重癥患者，11株產OXA-48型碳青霉烯酶的菌株中，10例來自下級醫院，而且入院前已有多日當地醫院治療史，病情較重，轉院后均入住ICU，這也說明對入院患者，尤其是入住ICU的患者，入院時進行CRE主動篩查是非常必要的。有2株菌株同時產KPC和OXA-48型碳青霉烯酶，為產碳青霉烯酶復合酶的菌株。有1株常見的5種基因型檢測結果均為陰性，可能為罕見基因型或其他耐藥機制。

本研究中，無菌體液中分離的CRE未出現對替加環素耐藥的菌株，對常見的抗菌藥物呈普遍耐藥。醫院對無菌體液中分離的CRE采取的抗感染措施為大劑量碳青霉烯類、替加環素及其他抗菌藥物兩藥或三藥聯合使用。聯合用藥方案發揮抗菌藥物之間的協同作用，優于單藥治療，能夠有效降低病死率[13]。目前，針對CRE的聯合治療方案常用兩藥聯合，如以替加環素為基礎聯合碳青霉烯類或氨基糖苷類或磷霉素。對于重癥患者及深部位感染，可考慮三藥聯合治療[14]。除替加環素外，治療CRE感染的藥物還有多黏菌素類和頭孢他啶/阿維巴坦。多黏菌素類主要殺菌機制是藥物所帶的正電荷與細菌細胞膜上的負電荷脂多糖結合，進而破壞細胞膜發揮殺菌作用[15]。頭孢他啶/阿維巴坦主要抗菌機制是阿維巴坦抑制多種類型的β-內酰胺酶，進而保護頭孢他啶的殺菌作用[16]。不同種類的抗菌藥物對產不同碳青霉烯酶菌株的抗菌活性不同[17-18]，如頭孢他啶/阿維巴坦對產 KPC 和 OXA-48 型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產金屬 β-內酰胺酶菌株無抗菌活性。不恰當的抗感染治療影響患者的結局[19]。根據不同碳青霉烯酶的特征開展聯合藥敏試驗，有助于制訂精準的抗感染治療方案[20]。因此準確、快速地對 CRE產生的碳青霉烯酶進行檢測分型，對于臨床抗感染治療的精準用藥和醫院感染預防控制具有重要的價值，實驗室應結合自身條件及臨床需求開展碳青霉烯酶型的檢測。