鹽度、溫度和光照對廣西沿海牟氏角毛藻生長的影響

朱昔恩，林原有，項(xiàng)桂德，熊建華，陳田聰，陳曉漢，張 彬

（廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

【研究意義】牟氏角毛藻可作為對蝦幼體培育的高營養(yǎng)優(yōu)質(zhì)生物餌料［1］，而且由于該藻可利用海水養(yǎng)殖中的代謝物N、P，因此可降低養(yǎng)殖水體中氨氮和磷酸鹽的濃度，從而改善和維持良好的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)［2-3］。廣西沿海防城港海區(qū)是浮游藻類密集區(qū)，富含尖刺擬菱形藻、擬旋鏈角毛藻等［4］。本研究結(jié)合廣西沿海防城港海區(qū)的氣候和水質(zhì)條件，探討牟氏角毛藻生長的適宜條件，為規(guī)模化培育提供參考。【前人研究進(jìn)展】目前，已有較多對牟氏角毛藻規(guī)模化培育環(huán)境因子的相關(guān)研究［5-6］。Elizerberth 等［1］研究了鹽度、溫度、光照周期與強(qiáng)度對牟氏角毛藻營養(yǎng)吸收和生物量產(chǎn)生的影響；班劍嬌等［7］研究認(rèn)為，鹽度20‰時牟氏角毛藻生長最佳；孟天等［8］研究了溫度和光照強(qiáng)度等對牟氏角毛藻生長的影響；曾蓓蓓等［9］認(rèn)為牟氏角毛藻的生長受溫度、鹽度、光照強(qiáng)度等因子的交互作用影響；Tasneema 等［10］在鹽度逐漸增加的條件下，開展了聯(lián)合和分步培養(yǎng)牟氏角毛藻生產(chǎn)巖藻黃素的研究；欒會妮等［11］研究發(fā)現(xiàn)，一些耐高溫角毛藻在試驗(yàn)設(shè)置的不同鹽度、溫度和光照梯度下均能生長，具有廣溫、廣鹽和廣光照的特性，可適應(yīng)高溫和高鹽；駱云慧等［12］對浮游植物群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)因子進(jìn)行典型對應(yīng)分析，認(rèn)為硅藻門種群變化主要與溫度、鹽度、pH 密切相關(guān)，牟氏角毛藻在凡納濱對蝦生態(tài)養(yǎng)殖初期和后期均為優(yōu)勢種。但由于藻種來源及所處地域氣候環(huán)境的差異，上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果差異顯著，表明環(huán)境因子對藻類的生長影響顯著。【本研究切入點(diǎn)】牟氏角毛藻屬于海洋浮游硅藻，具有廣鹽、廣溫、繁殖快、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，是蝦蟹貝類幼體培育的優(yōu)質(zhì)餌料，較多文獻(xiàn)報(bào)道顯示，受藻種來源和區(qū)域氣候水質(zhì)環(huán)境等影響，不同環(huán)境因子對牟氏角毛藻的生長影響存在較大差異。本研究結(jié)合廣西防城港海區(qū)氣候和水質(zhì)等因素［4，13］探討高效培育牟氏角毛藻的適宜環(huán)境因子。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過設(shè)置不同鹽度、溫度、光照強(qiáng)度等環(huán)境因子開展研究，篩選獲得在廣西沿海區(qū)域?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定高效培育牟氏角毛藻的適宜條件，為其規(guī)模化培育生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牟氏角毛藻藻種于2019 年7 月從廣西防城港市港口區(qū)企沙鎮(zhèn)玉石灘近岸海水中分離得到，并由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院海水藻種室純化保種。培養(yǎng)基配方如下：75 mg/L 硝酸鈉、5 mg/L 磷酸二氫鉀、30 mg/L 硅酸鈉、3.9 mg/L 檸檬酸鐵、0.178 mg/L 氯化錳、1 μg/L 硫酸銅、23 μg/L 硫酸鋅、7.3 μg/L 鉬酸鈉、12 μg/L 氯化鈷、4.35 μg/L EDTA-二鈉、0.1 mg/L 維生素B1、0.5 μg/L 維生素B12，以上試劑均為分析純。

1.2 藻類培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020 年6 月，按上述配方進(jìn)行牟氏角毛藻藻種接種擴(kuò)繁，連續(xù)擴(kuò)培至指數(shù)生長期。取20 mL指數(shù)生長期的牟氏角毛藻藻液至含有200 mL 營養(yǎng)液的玻璃錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，pH 8.0±0.1，光暗周期L∶D=12 h∶12 h，培養(yǎng)期間每天定時搖晃2 次錐形瓶，隨機(jī)更換錐形瓶位置減少光照差異，每個因子設(shè)置3 個重復(fù)。培養(yǎng)10 d 后測定藻數(shù)量。各試驗(yàn)梯度設(shè)計(jì)如下：鹽度試驗(yàn)設(shè)置0‰、低鹽處理（5‰、10‰）、中鹽處理（20‰、30‰）、高鹽度處理（35‰、40‰）等7 個梯度，溫度25（±1）℃、光照強(qiáng)4 000 lx；溫度試驗(yàn)設(shè)置25、28、31、34 ℃等4個梯度，鹽度20‰、光照強(qiáng)度4 000 lx；光照強(qiáng)度試驗(yàn)設(shè)置1 000、4 000、7 000 lx 等3 個梯度，鹽度20‰、溫度25（±1）℃。

1.3 指標(biāo)測定

試驗(yàn)期間，每天定時測定藻細(xì)胞濃度，采用XB-K-25 血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡（Nikon ECLIPSE-E100）下計(jì)數(shù)，每個樣品計(jì)數(shù)3 次。計(jì)算生長速率（K）：

K（%）=（lnNt-lnN0/t）×100

式中，Nt是培養(yǎng)第t 天的藻細(xì)胞密度，N0為初始藻細(xì)胞密度，t 為培養(yǎng)天數(shù)。

利用Excel 軟件進(jìn)行圖表制作，采用SPSS22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算以及單因素方差分析，若組間差異顯著，則作Duncan’s多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對牟氏角毛藻生長的影響

由圖1 可知，牟氏角毛藻在5‰～40‰鹽度條件下均能生長，0‰鹽度條件下生長緩慢，且與其他鹽度處理差異顯著，中鹽度處理（20‰～30‰）藻細(xì)胞密度最高，低鹽度處理（5‰～10‰）次之，高鹽度處理（35‰～40‰）藻細(xì)胞密度最小，且生長速度最慢。表1 顯示，中鹽度處理（20‰～30‰）的生長速度和藻細(xì)胞密度均達(dá)到最高，兩者增長速率差異不顯著，但鹽度20‰的藻體保持活性周期較長，藻細(xì)胞密度最大，略優(yōu)于30‰鹽度，為最佳鹽度。低鹽度處理（5‰～10‰）和高鹽度處理（35‰～40‰）的藻細(xì)胞密度和生長速率在各個生長時期差異均不明顯。

圖1 不同鹽度下牟氏角毛藻的生長曲線Fig.1 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different salinity

表1 不同鹽度下牟氏角毛藻生長期的最大藻細(xì)胞密度和生長速率Table 1 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different salinity

2.2 溫度對牟氏角毛藻生長的影響

由圖2 可知，牟氏角毛藻培育的最佳溫度是31 ℃，該溫度下4 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)到峰值6.975×106cell/mL，之后緩慢死亡；而34 ℃下3 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)到峰值6.371×106cell/mL，維持2 d 后迅速死亡；此外，28 ℃下4 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)到峰值5.9×106cell/mL，隨后進(jìn)入消亡期；25 ℃下6 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)到峰值4.492×106cell/mL，其藻細(xì)胞密度最小，但穩(wěn)定期時間最長。表2 顯示，不同溫度下牟氏角毛藻的生長速度差異顯著，其中溫度與生長速率呈正相關(guān)，而最大藻細(xì)胞密度在31℃下最高，34℃溫度組次之，均顯著高于25、28℃溫度處理。

圖2 不同溫度下牟氏角毛藻的生長曲線Fig.2 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different temperatures

表2 不同溫度下牟氏角毛藻生長期的最大藻細(xì)胞密度和生長速率Table 2 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different temperatures

2.3 光照強(qiáng)度對牟氏角毛藻生長的影響

由圖3 可知，牟氏角毛藻生長所需的最佳光照強(qiáng)度是4 000 lx，在該光照強(qiáng)度下藻細(xì)胞密度顯著高于其他處理；而在1 000 lx 和7 000 lx 下生長相對緩慢，前3 d 各處理均處于指數(shù)生長期，呈上升趨勢，4～5 d 后藻細(xì)胞濃度達(dá)到峰值，但藻細(xì)胞密度短暫穩(wěn)定后進(jìn)入衰亡期，其中1 000 lx 處理的藻細(xì)胞衰亡速度顯著高于其他處理。表3 顯示，牟氏角毛藻在4 000 lx 光照強(qiáng)度下的生長速率和最大藻細(xì)胞密度均顯著高于1 000 lx 和7 000 lx處理。

圖3 不同光照強(qiáng)度下牟氏角毛藻的生長曲線Fig.3 Growth curves of Chaetoceros muelleri at different light intensity

表3 不同光照強(qiáng)度下牟氏角毛藻生長期的最大藻細(xì)胞密度和生長速率Table 3 Maximum algal cell density and growth rate of Chaetoceros muelleri at different light intensity

3 討論

鹽度對海水養(yǎng)殖生物的滲透壓、生長、發(fā)育等影響顯著，鹽度變化對海洋微藻的生長和生理反應(yīng)同樣產(chǎn)生較大影響［14-15］。本研究結(jié)果表明，牟氏角毛藻在5‰～40‰鹽度條件下均能生長，但綜合生長速度、藻細(xì)胞密度、指數(shù)生長期穩(wěn)定時長和衰亡速度等指標(biāo)參數(shù)，中鹽度處理（20‰～30‰）是牟氏角毛藻穩(wěn)定培養(yǎng)的適宜鹽度范圍，其中最適鹽度為20‰。張平等［14］研究認(rèn)為，21‰～26‰鹽度范圍內(nèi)角毛藻的藻細(xì)胞生長速度較快，與本研究結(jié)果一致。班劍嬌等［7］報(bào)道，20（±1）‰鹽度條件下牟氏角毛藻的藻細(xì)胞濃度和生長速率均表現(xiàn)最佳，與本研究結(jié)果得到的最適鹽度值20‰相一致。此外，一些報(bào)道也顯示角毛藻生長的適合鹽度范圍為10‰～30‰［9，16-17］，表明不同種類及分布海域的差異也會導(dǎo)致角毛藻對鹽度的適應(yīng)性存在一定差異。此外我們在試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，0‰鹽度處理的牟氏角毛藻前3 d 就出現(xiàn)部分死藻，之后出現(xiàn)持續(xù)增長的現(xiàn)象，推測可能是該藻通過較長時間的低鹽環(huán)境馴化及調(diào)整自身生長生理狀態(tài)，逐步適應(yīng)了淡水環(huán)境而部分恢復(fù)增殖生長。

溫度是影響海洋單胞微藻生長和繁殖最重要的生態(tài)因子之一，其對酶的活性、營養(yǎng)物的吸收及細(xì)胞分裂周期等均產(chǎn)生較大影響［18-20］。本研究中廣西沿海防城港海區(qū)牟氏角毛藻在25～34 ℃范圍內(nèi)均能正常生長繁殖，其適宜生長溫度范圍為28～31 ℃，最適生長溫度是31℃，屬于耐高溫的海洋微藻，這與文獻(xiàn)［8，11］報(bào)道的角毛藻具有耐高溫特性的結(jié)果一致。但溫度波動頻率和幅度越大對牟氏角毛藻的生長速率和藻細(xì)胞密度越不利。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在適宜溫度范圍外的低溫（25 ℃）條件，牟氏角毛藻呈現(xiàn)緩慢生長狀態(tài)，而當(dāng)溫度升至適宜溫度時隨即迅速恢復(fù)生長，推測可能是低溫對牟氏角毛藻生長產(chǎn)生了短暫的抑制效應(yīng)，這一分析與茅華等［17］的研究結(jié)論相一致。

光照強(qiáng)度對海洋微藻的生長速率和繁殖也起到至關(guān)重要的作用［21］。多數(shù)海洋微藻對光能有相同的適應(yīng)生理，對光照強(qiáng)度有一個光飽和點(diǎn)。低于光飽和點(diǎn)時，隨著光照強(qiáng)度增加，生長速率增加；高于光飽和點(diǎn)時，生長速率減慢［22-23］，這種變化趨勢與本研究結(jié)果類似。本研究表明，牟氏角毛藻生長的最適光照強(qiáng)度為4 000 lx，培養(yǎng)3 d 后藻細(xì)胞密度達(dá)到峰值；孟天等［8］研究認(rèn)為，10 000 lx 為牟氏角毛藻生長的最適光照強(qiáng)度，歷時12 d 達(dá)到最大藻細(xì)胞密度，這與本研究結(jié)果存在差異，而茅華等［17］認(rèn)為，旋鏈角毛藻在4 000 lx 條件下生長最好，與本研究中牟氏角毛藻的最適光照強(qiáng)度相一致。分析上述研究結(jié)果的差異，這是因?yàn)榄h(huán)境因子間存在交互作用［24］，同種微藻的生長存在一定差異，而同屬不同種間又存在一定相似性。海洋微藻的正常生長需要適宜的光照強(qiáng)度范圍，過高會破壞微藻藻細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致藻細(xì)胞生長減緩和死亡，低光照條件對微藻藻細(xì)胞的生長也有不利影響，同種藻不同地理分布的藻株，其最適光照強(qiáng)度也可能存在差異，推測上述這些現(xiàn)象的產(chǎn)生與各種海洋微藻及其不同地理分布藻株各自所處的海區(qū)氣候和水質(zhì)環(huán)境有極大關(guān)聯(lián)。后續(xù)研究將綜合環(huán)境因素（光照、溫度、鹽度等）和營養(yǎng)鹽因素，進(jìn)一步明晰廣西沿海防城港海區(qū)牟氏角毛藻在上述因素正交試驗(yàn)下的培育生長效果，以期為穩(wěn)定、高效、規(guī)模化培育牟氏角毛藻提供技術(shù)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究對從廣西沿海防城港海區(qū)分離純化的牟氏角毛藻藻種，結(jié)合該區(qū)域氣候和海水水質(zhì)環(huán)境，綜合藻細(xì)胞生長速度、藻細(xì)胞密度、藻細(xì)胞指數(shù)生長期穩(wěn)定時長和藻體衰亡時間等指標(biāo)進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論：從廣西沿海區(qū)域獲得的牟氏角毛藻具有耐高溫和高鹽的特性，其最佳的培養(yǎng)鹽度、溫度和光照強(qiáng)度分別為20‰、31℃和4 000 lx，且三者對牟氏角毛藻的生長均產(chǎn)生顯著影響。