昆蟲氣味受體研究進展

祁全梅，李秋榮

（青海省農林科學院/青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室/農業農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海 西寧 810016）

昆蟲是動物界中最大的一個類群，它們通過視覺、聽覺、觸覺、嗅覺等感官來感受外界環境，能精確嗅到周圍環境中氣味物質的細微變化，在長期進化過程中，形成了高度特化、極其靈敏的嗅覺系統。昆蟲的嗅覺是行為感覺的一種重要信號輸入來源，是其生存和繁衍的關鍵［1］。靈敏的嗅覺對昆蟲的生活習性有著直接或間接的影響，在一定距離范圍內，昆蟲利用嗅覺感器識別環境中各種不同的氣味分子，包括寄主植物、異性、天敵等釋放的化學信號來確定飛行方向，從而定位寄主植物、尋找配偶、控制交尾、選擇產卵場所、警惕和躲避天敵等，因此，嗅覺系統對昆蟲生存和繁衍后代尤為關鍵。

寄主植物揮發性化合物的主要化學成分包括飽和及不飽和脂肪族醛類、酮類、醇類和酯類、烯萜類等，這些成分在化學感受過程中，主要發揮以下3 種功能：一是吸引害蟲，幫助搜索食物或選擇產卵地；二是驅避害蟲，阻止取食植物或阻止產卵；三是吸引瓢蟲、食蚜蠅、寄生蜂等天敵昆蟲。通過研究揮發性化合物對植食性昆蟲桔小實蠅Bactrocera dorsalis的作用，發現香梨、桃、甜橙和檸檬的揮發物對桔小實蠅的嗅覺行為產生影響，它們均對桔小實蠅雌蟲具有顯著的引誘活性，由此可知，植食性昆蟲的嗅覺系統對寄主植物的揮發物反應非常敏感，而且揮發物在昆蟲的生存和繁殖中具有重要作用［2-5］。

昆蟲性信息素是由雌蟲或雄蟲分泌，被同種異性個體的嗅覺感受器所接受，并引起異性個體產生覓偶定向、求偶交配等生殖行為反應的微量揮發性化合物，主要功能是調控昆蟲的求偶、交尾等性行為，因此，性信息素及相應的嗅覺感受對昆蟲繁衍后代尤為關鍵。有些種類的昆蟲還會產生聚集信息素、報警信息素等，這些信息素被同種其他昆蟲感受到之后會觸發相應的行為。寄主植物揮發物、昆蟲性信息素、聚集信息素以及報警信息素被統稱為“氣味分子”或“信息化合物”。

對昆蟲嗅覺的研究起初主要集中在果蠅、家蠶和東亞飛蝗等模式昆蟲，隨著科學技術不斷發展，對其他種類的昆蟲嗅覺識別機制的探索也受到了廣泛關注，由于昆蟲嗅覺系統在昆蟲行為中起著十分重要的作用，嗅覺系統中的蛋白成為潛在的防治分子靶標，因此昆蟲嗅覺相關基因及其編碼蛋白在氣味識別過程中所發揮的作用以及嗅覺識別的機制逐漸成為研究熱點。在昆蟲對氣味的識別過程中有多種蛋白質參與，嗅覺系統中的主要蛋白家族包括氣味結合蛋白（Odorant-binding Proteins，OBPs）、化學感受蛋白（Chemosensory Proteins，CSPs）、氣味受體（Odorant Receptors，ORs）、離子型受體（Ionotropic Receptors，IRs）、感覺神經元膜蛋白（Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs）和氣味降解酶（Odorant Degrading Enzyme，ODE）等［6］，它們在主導調節昆蟲的取食、交配和產卵等一系列行為中發揮著重大作用。其中，氣味受體是化學感受系統中更為核心的元件，ORs 對氣味分子的專一性識別過程是最為關鍵的環節，而ORs 介導的氣味分子與嗅覺神經元的專一性結合是重要的嗅覺識別基礎，在決定化學感受的專一性、敏感性及昆蟲特定行為的輸出方面具有更為重要的作用。

研究昆蟲ORs 的氣味分子反應譜、ORs-信息化合物-行為三者之間的關系以及ORs 的具體功能，可以解釋昆蟲行為產生的分子基礎，明確害蟲經由ORs 調控的嗅覺識別分子機制，有助于了解害蟲種間以及與寄主植物、天敵之間的通訊關系，為開發對害蟲有效的食物引誘劑、食物驅避劑或聚集信息素等奠定理論基礎，從應用角度看，有助于開發新的防控技術與方法，加快食誘劑、拒食劑和聚集信息素等在害蟲防控上的應用步伐。研究ORs與揮發性化合物、行為之間的關系，是闡明昆蟲對化學信號進行識別的分子機制的一個重要環節，深入探索昆蟲嗅覺相關基因的功能，將有助于昆蟲嗅覺識別機制的研究，進而通過調節昆蟲嗅覺識別過程，控制昆蟲相關行為，為害蟲的預防和治理提供綠色、安全的新方法，為闡釋昆蟲行為的產生機理奠定分子基礎。

1 昆蟲氣味受體的鑒定與分類

1.1 氣味受體的鑒定

氣味受體是一種由嗅覺細胞表達的蛋白，能與氣味分子結合，屬于多基因超家族。20 世紀90 年代初，首次發現于大鼠和人類的嗅覺上皮細胞［7-8］，隨后，科學家經過不斷地探索，先后從脊椎動物鳥類、魚類、兩棲動物等體內克隆到相似的ORs 基因［9-10］，從無脊椎動物線蟲中篩選得到ORs 基因［11］。昆蟲研究者最初通過設計ORs 簡并引物進行PCR 擴增，均未能成功，使昆蟲ORs 基因的鑒定在一定程度上受阻。而后受益于基因組、轉錄組技術及生物信息學的快速發展，完成了多種昆蟲的基因組測序，使昆蟲ORs 基因得以快速鑒定。昆蟲的第一個ORs 基因在黑腹果蠅Drosophila melanogaster體內發現，它類似于G 蛋白偶聯受體的神經肽受體［12］，通過生物信息學手段、RNA 原位雜交技術等明確了果蠅的19 種嗅覺基因［13］，隨后，在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目和直翅目等昆蟲體內陸續發現并鑒定得到ORs，從果蠅屬Drosophila、赤擬谷盜Tribolium castaneum、中華蜜蜂Apis cerana cerana、家蠶Bombyx mori、岡比亞按蚊Anopheles gambiae、稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus、棉蚜Aphis gossypii、柑橘木虱Diaphorina citri和亞洲小車蝗Oedaleus decorus asiaticus等昆蟲中分別鑒定到62、259、170、64、79、41、45、46、60 個ORs 基因［14-22］。

1.2 氣味受體的分類

氣味受體分為兩個大類：一類為傳統氣味受體（Conventional Odorant Receptors，ORs），另一類為非典型氣味受體（Odorant Receptor Coreceptor，ORCO），傳統型氣味受體又分為普通氣味受體（Original Odorant Receptors，OORs）和性信息素氣味受體（Pheromone Receptors，PRs），每種昆蟲有多個ORs 和1 個ORCO。不同種類昆蟲含有的ORs 基因的數量存在較大差別，受體間的同源性較低，僅約20%，且在少數嗅覺神經元中表達；而ORCO 則具高度保守性，同源性最高可以達到99%，在大多數嗅覺神經元中表達。不同種類昆蟲的非典型氣味受體的名稱有所不同，黑腹果蠅的非典型氣味受體被命名為Or83b［23］，鱗翅目的非典型氣味受體被命名為OR2［24］。非典型氣味受體是ORs 形成有選擇性的離子通道、正常發揮功能所必須的蛋白組分［25］，不能識別氣味分子，與ORs 共表達并協助其完成對氣味分子的識別過程。

2 昆蟲氣味受體的蛋白結構與表達

2.1 氣味受體的蛋白結構

昆蟲ORs 是位于嗅覺感受神經元樹突膜上的一種疏水性膜蛋白，編碼約300～600 個氨基酸，其N 端不存在信號肽，但有一個保守的糖基化位點，胞內的環上存在幾個潛在的磷酸化位點。由于此類膜蛋白的含量很低，解析它們的蛋白晶體結構困難較大，目前僅有高度保守的非典型氣味受體ORCO 的結構被解析［26］。

曾經認為昆蟲的ORs 結構與典型的脊椎動物G 蛋白偶聯受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR）相同，C 端在細胞膜內，N 端在細胞膜外（圖1 左）。但21 世紀初，通過抗體標記實驗，在果蠅、岡比亞按蚊體內發現多種ORs 基因的N 端在細胞膜內，而C 端在細胞膜外（圖1 右），與脊椎動物的ORs 分子結構恰好相反，此結果符合隱含馬爾科夫模型。因此，推斷昆蟲的ORs 基因不屬于G 蛋白偶聯家族，說明昆蟲和脊椎動物在進化過程中可能形成了兩種不同的嗅覺系統，昆蟲ORs基因可能與典型的GPCR有不同的進化起源。

圖1 哺乳動物（左）和昆蟲（右）的氣味受體結構模式［26］Fig.1 Structural model of odorant receptors in mammalian（left）and insect（right）

昆蟲ORs 蛋白結構的典型特征是大多包括7個長度為19～26 個氨基酸的疏水區，即7 次α-螺旋跨膜蛋白（TM）形成的結構域，該區域包含一個保守片段〔Phe-Pro-X-Cys-Tyr（X）20-Trp〕，其中，保守性最高的是橫跨第6 和第7 跨膜區域的C 端。除保守區外，跨膜3、4、5 區的序列都顯示出高度多樣性，類比7 次α-螺旋跨膜蛋白結構，發現3、4、5 區是氣味分子識別和結合區域的一部分，已在3、4、5 區確定了 17 個高度可變的氨基酸殘基，ORs 跨膜3、4、5 區的可變氨基酸殘基可能與氣味識別多樣性有關。

2.2 氣味受體的表達

不同氣味受體基因在昆蟲發育各個階段的表達情況不盡相同。從果蠅基因組中發現了60 個ORs 基因，其中，只有23 個在幼蟲期表達，43個在成蟲期表達［27］，中黑盲蝽AsutOrco主要在成蟲期表達，且在雌、雄蟲觸角內高表達［28］，煙夜蛾HassOr83b在幼蟲各齡期皆有表達，HassOr83b和HassOr18在煙夜蛾成蟲觸角和喙內高表達，而其他蟲體組織無表達［29-30］，柑桔木虱DcitOrco在若蟲和成蟲期表達量較低且穩定，而8 個DcitORs在該蟲各發育階段均表達，且在若蟲期表達量更高［31］。

普通氣味受體基因在昆蟲不同性別、不同組織或器官中的表達存在一定差異。甜菜夜蛾SexiOR3和SexiOR18這兩個氣味受體基因主要在觸角表達，且在雌蟲觸角中的表達量明顯高于雄蟲觸角［32］；李兆群采用轉錄組測序技術，從大草蛉、中華通草蛉體內分別鑒定得到39 個、37 個ORs 基因，這些ORs 基因在觸角內高表達或特異表達，其中，CpalOR11、CpalOR14、CpalOR17及CpalOR25在除觸角外的其他組織也有少量表達［33］；采用半定量PCR 分析ORs 基因在小菜蛾觸角和其他嗅覺感器中的表達，發現ORs 主要在觸角內表達，其中，PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18在觸角中大量表達，且雌雄成蟲之間沒有顯著差異，PxylOR17在雌蛾生殖器中有一定表達，PxylOR18在雌蛾腹部也有表達［34］；中華按蚊Anopheles sinensis和中華蜜蜂Apis cerana cerana的氣味受體基因ORs 在觸角的表達量顯著高于其他組織［35-36］；對綠盲蝽110個ORs 在4 種組織進行半定量，其中，兩性成蟲觸角中各有2 個特異表達的AlucORs，分別有10個和18 個ORs 在雌、雄蟲觸角中的表達量高于頭部、胸部和腹部等其他組織［37］。

非典型性氣味受體基因在同種昆蟲的不同組織或器官中的表達量各異。桃蛀螟CpunOrco主要在雌、雄蛾觸角及下顎表達，在胸部、腹部和足等組織也有少量表達［38］，甜菜夜蛾SexiOR2在毛形、腔錐形和錐形感器中有表達，在栓錐形和刺形嗅覺感器中無表達［24］，綠盲蝽AlucOrco在雌成蟲觸角中的表達量顯著高于雄成蟲觸角［39］，麗蠅科絲光綠蠅LserOrco和大頭金蠅CmegOrco在觸角和下顎須中大量表達，在雌蟲產卵器中微量表達，而在胸部無表達，且這兩種麗蠅科昆蟲非典型氣味受體基因的表達量均隨蟲齡增長而增加［40］，埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦庫蚊Culex quinquefasciatus的ORCO 基因在它們的觸角、下顎須和喙中均有表達［41-42］，而ORCO 只在斜紋夜蛾Spodoptera litura和中紅側溝繭蜂Microplitis mediator的觸角中特異表達［43-44］。在昆蟲的不同嗅覺神經元上，表達的ORs 基因的數量也存在差異。一個嗅覺神經元可以表達一個氣味受體基因，可以表達多個ORs 基因，也有些神經元不表達ORs 基因［45］。

3 昆蟲氣味受體的功能

3.1 氣味受體功能研究方法

3.1.1 解析氣味受體配體的方法 研究昆蟲氣味受體基因的功能，可為深入了解昆蟲識別氣味分子的嗅覺分子機制提供理論依據。研究昆蟲氣味受體的功能，可通過測定ORs 的氣味分子反應譜，從中篩選有生物學功能的配體，解析ORs 配體的方法主要有兩種：

一是體外驗證法，即通過異源細胞表達系統篩選，異源細胞表達系統包括：（1）非洲爪蟾卵母細胞表達系統，是在體外研究昆蟲ORs基因功能、驗證ORs 基因配體方面的一個較常用、較成功的系統。該技術先在體外合成ORs 和ORCO 基因的cRNA，注射到爪蟾卵母細胞中，經過孵育培養，使用雙電壓電壓鉗在浴液中記錄卵細胞對氣味刺激的反應，爪蟾卵母細胞個體大、易培養且利于膜蛋白-ORs 基因表達。利用非洲爪蟾卵母細胞表達系統，已完成了甜菜夜蛾Spodoptera exigua［46］、斜紋夜蛾S.litura［47］和煙青蟲Heliothis assulta［48］等多種昆蟲ORs 的功能驗證。（2）其他異源細胞表達系統，主要有草地貪夜蛾Spodoptera frugiperdaSf9 卵巢細胞表達系統、HEK293 人胚腎細胞表達系統，HEK293 細胞表達系統是一個較為常用的研究外源基因功能的細胞系統，Sf9 細胞是一種昆蟲表達系統的宿主細胞，這兩個表達系統類似，將外源ORs 和Orco在細胞中共表達后，用不同的氣味分子刺激細胞，通過鈣成像系統測得受刺激后細胞內的Ca2+濃度升高［49］。（3）果蠅“空神經元”表達系統，通過分子遺傳學方法構建UAS/GAL4 基因異位表達調控系統，可將任何基因在果蠅的特定組織和細胞內表達。利用此種方法建立了果蠅的錐形感器和毛形感器這兩種感器的受體神經元缺失品系，可為不同感器中表達的氣味受體提供與蟲體內相似的生理環境。果蠅的錐形感器中包含2個神經元ab3A 和ab3B，ab3A 中表達的是OR22a和OR22b，人工敲除OR22a 和OR22b 基因獲得的神經元被稱為△ab3A 空神經元是常用的果蠅受體神經元缺失突變體。通過UAS/GAL4 系統將外源ORs 特異性地表達于△ab3A 空神經元中，由OR22a 啟動子驅動表達，利用單感器（Single Sensillum Recording，SSR）記錄錐形感器ab3，從而獲得外源ORs 對應的氣味分子反應譜［50］。此外，開發了果蠅毛形感器受體神經元OR67d 缺失品系，通過將外源氣味受體基因ORs 特異的表達在黑腹果蠅的毛形感器△T1 空神經元中，在OR67d啟動子驅動下表達，通過SSR 記錄發現目的ORs對某些信息素受體有很好的反應譜，解決了在毛形感器中某些ORs 不適合在錐形感器中表達的問題［51］。可能是由于果蠅感器能為ORs 基因提供類似于昆蟲體內的生理環境和蛋白組件，果蠅“空神經元”表達系統反應比其他方法更靈敏，實驗結果更為精確，已有果蠅、岡比亞按蚊Anopheles gambiae和灰翅夜蛾Spodoptera littoralis的ORs基因家族使用果蠅“空神經元”法驗證了它們的氣味配體種類［49-51］。

二是體內驗證法，即在昆蟲體內篩選，利用即刻早期基因（Immediate Early Genes，IEGs）可以指示ORs 對外界氣味分子的反應這一原理，篩選目標ORs 的配體，這種方法首先在小鼠、果蠅和家蠶上得到驗證，家蠶在受到蠶蛾醇這種性信息素刺激后，其性信息素受體基因BmorOR1與即刻早期基因BmHr38共表達與同一個神經元中［52］，而這種方法到目前應用仍很少。

3.1.2 RNAi 技術 RNAi 是一種轉錄后基因調控機制，主要用于靶標基因沉默，由于具有高度的序列特異性，而且抑制效果良好，操作簡單，周期短，成為基因功能研究的重要工具。斑翅果蠅在注射ORCO dsRNA 24 h后很難準確找到食物源，且大多數個體飛行無規則，化學行為明顯降低，而注射無RNase 水的斑翅果蠅大多數能準確找到食物源且較活躍，說明dsRNA 沉默了ORCO 基因的表達，降低了該蟲的嗅覺能力，證實了ORCO在斑翅果蠅的嗅覺感受中發揮著重要作用［53］。利用RNAi 技術沉默松墨天牛Monochamus alternatus非典型性氣味受體基因ORCO，導致引誘劑、松節油及性信息素引起的電位降低，使該蟲對氣味分子的行為趨向表現為隨機性，因此，ORCO 基因的沉默可能會對松墨天牛正常的嗅覺識別過程造成影響［54］。

3.1.3 新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9 技術基因組編輯是對基因功能進行分析的一種重要的生物學工具，CRISPR/Cas9 基因編輯技術是繼TALEN 基因編輯技術之后又一重大突破，該技術通過RNA 指導Cas9 核酸酶對靶向基因進行特定DNA 編輯，效率更高，Cas9 系統的載體構建與使用也更加便捷，是目前使用廣泛的新一代基因編輯技術。利用CRISPR/Cas9 技術將東亞飛蝗的聚集信息素受體LmigOR35基因敲除后，東亞飛蝗觸角對 LmigOR35 的配體4-乙烯基苯甲醚（4-vinylanisole，4VA）的電生理反應以及4VA 對飛蝗的吸引效應顯著降低［55］。煙草天蛾Manduca sexta的非典型性氣味受體基因ORCO 被敲除后，該蟲的覓食行為受到影響，而產卵行為不受影響［56］。

3.2 傳統氣味受體的功能

氣味受體分布在嗅感神經元樹突的膜表面，氣味分子或是其與OBPs 的復合物可以激活相應的ORs 傳遞嗅覺信號，使昆蟲產生反應，ORs 主要起識別氣味分子的作用。果蠅的氣味受體基因DOr43能被環己酮、環己醇、苯甲醛和苯甲醇等氣味物質激活［57］，稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis氣味受體基因CmedOr1的唯一配體是苯乙醛，而苯乙醛可誘集多種鱗翅目昆蟲［58-59］，家蠶的氣味受體基因BmOr1能夠識別、感知蠶蛾醇這種性信息素［60］，煙青蟲H.assulta、歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉鈴蟲Helicoverpa armigera等鱗翅目昆蟲的個別ORs 基因也可以識別性信息素［61-62］。果蠅的氣味受體基因DOr22a和DOr22b 被敲除后，其失去了對氣味分子的敏感性［63］，埃及伊蚊AaOr8 和AaOr49 對該蟲定位宿主、吸血具有很重要的作用［64］。

3.3 非典型氣味受體的功能

昆蟲的非典型氣味受體ORCO 的功能與傳統ORs 不同，ORCO 不能單獨識別氣味分子，該基因的缺失會使昆蟲嗅覺受損，細胞系通常需要將ORs 和ORCO 基因同時導入到細胞中，與ORs基因形成復合體才能把外界的氣味分子正確定位到體內嗅覺神經元的位點上，從而提高ORs 基因對氣味分子反應的靈敏度，除非細胞系細胞可以表達內源性的類似ORCO 的蛋白ORCO 介導的氣味分子和嗅覺神經元的特異性結合是昆蟲重要的嗅覺識別基礎，其與ORs 相互作用形成的異源二聚體對昆蟲的嗅覺具有重要作用［65］。家蠶的BmorOrco基因被敲除后，其對兩種性信息素（E，Z）-10，12-十六碳烯醇和反-10，順-12-十六碳二烯醛均無反應，且影響成蟲的交配和幼蟲對桑葉的選擇行為［66］，果蠅的DOrco基因被敲除后，其喪失了對供試氣味的選擇性，經過轉基因技術營救后又能恢復正常［21］。沉默ORCO基因后，導致赤擬谷盜的對引誘劑、性信息素以及氣味劑的感受能力下降，正常的氣味識別過程被影響［67］?？梢姡ハx的ORCO 基因在其嗅覺中占有不可或缺的地位。

4 問題與展望

由于普通氣味受體在不同昆蟲之間的同源性較低，最初用生物序列的同源性搜索方法尋找昆蟲的氣味受體基因并未能成功，后來，研究者利用用分子生物學和生物信息學方法，第一次從昆蟲——果蠅的基因組中鑒定到氣味受體基因。大量研究表明，成功篩選并鑒定氣味受體基因主要是建立在對昆蟲基因組學研究的基礎上，同時，證明氣味受體基因廣泛存在于昆蟲基因組中［68］，隨著越來越多昆蟲基因組測序完成，氣味受體基因的篩選和鑒定工作得到了迅猛發展。受益于現代分子生物學技術，從爪蟾卵母細胞表達系統、HEK293、Sf9 細胞表達系統和果蠅“空神經元”表達系統等異源細胞表達系統，到昆蟲本體內篩選技術，再到RNAi 技術、新一代基因編輯CRISPR/CAS9 技術等新型技術的快速發展及其在氣味受體功能研究中的應用，使人們對氣味受體的功能及分子作用機制的認識也越來越深入。然而，研究昆蟲氣味受體基因的功能所采用的一些技術仍存在一定局限性。雖然通過爪蟾卵母細胞表達系統、HEK293、Sf9 細胞表達系統，可大量篩選外源OR 的配體，操作也不復雜，但是這3 種異源細胞表達系統均缺乏CSP、OBP 和SNMP 成分，無法完全真實體現OR 的反應特征；而果蠅“空神經元”表達系統雖能真實體現外源OR 的反應特征，部分外源ORs 卻不能在該系統成功表達，加之操作難度較大，不利于高通量研究ORs 功能。研究對象亦存在局限性，雖然昆蟲氣味受體功能的研究對象由早期的模式昆蟲如家蠶、果、蚊子和飛蝗，已轉為研究重要的農作物、蔬菜害蟲，卻鮮見對于林業重要害蟲OR 功能方面的研究報道。當前，研究重點也主要放在了農作物、蔬菜害蟲對植物揮發物、性信息素的嗅覺感受功能與機制上，而忽視了對害蟲聚集信息素受體的鑒定和功能驗證，聚集行為在許多害蟲群體中是一種很常見的現象，聚集也是導致害蟲對農作物、蔬菜和林木造成重大災害的重要條件，今后有必要加強對害蟲聚集信息素受體的功能研究。

深入研究氣味受體基因的功能，闡明昆蟲覓食、交尾和產卵等的嗅覺行為反應分子機理，并將其與傳統的化學生態學、行為學相結合，有助于從分子生物學角度解釋氣味受體基因在昆蟲定位寄主植物、尋找交尾對象及產卵場所等行為過程中發揮的重要作用，進一步了解昆蟲一系列行為產生的機制機理，同時也可為研發綠色、高效的食物引誘劑和、驅避劑、性信息素引誘劑及聚集信息素等行為調控劑提供理論依據和技術支持。