干燥方式對黃連浸膏粉物理指紋圖譜和有效成分的影響

王瑜婷，徐東婷，鄧桂海，梁麗金，黃醒鵬，馬彩玲，劉燎原

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

黃連為毛茛科植物黃連Coptidis RhizomaFranch.、三角葉黃連Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其性寒，味極苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。現(xiàn)代藥理臨床應用研究表明，黃連的主要化學成分有生物堿類、木脂素類、黃酮類、酸性成分等，具有保護心腦血管、抗腫瘤、降血糖、抗病原微生物、抗炎以及改善消化系統(tǒng)等作用，對多種疾病的治療均有效[2]。

中藥浸膏粉是中藥制劑生產(chǎn)過程中的重要中間產(chǎn)物，其物理性質(zhì)直接影響到浸膏粉的貯存、混合、制粒、壓片等后續(xù)工藝操作的難易程度及最終產(chǎn)品的質(zhì)量[3]。干燥是中藥浸膏粉形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，中藥浸膏粉的干燥方式主要有常壓干燥、真空干燥、冷凍干燥和噴霧干燥等，干燥原理的不同，會導致干燥產(chǎn)物的物理性質(zhì)及成分含量的不同[4?5]。因此，本文研究了噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥、鼓風干燥4種干燥方式對黃連浸膏粉物理指紋圖譜及有效成分的影響，以期為黃連浸膏粉干燥方式的選擇及其相關(guān)制劑的研發(fā)提供指導與依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；YOD?230型冷凍干燥箱（美國Thermo Vanquish公司）；B?290型噴霧干燥機（瑞士Buchi有限公司）；DHG?9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DZF?6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；JZ?7型粉體振實密度儀（成都精新粉體測試設(shè)備有限公司）；JL?A3型粉體特性測試儀（丹東百特儀器有限公司）；SHH?250SD型穩(wěn)定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）；Milli?Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（瑞士METTLER TDLEDO公司）；KQ?500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TC?15型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；HWS?28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；YRE?501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ?D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵、DLSB?5L/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試劑與試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號：110713?202015，純度為85.90%，中國食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿對照品（批號：wkq20031310，純度為98.28%，四川省維克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司）；十二烷基硫酸鈉為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水；其他試劑為分析純。黃連藥材（批號：YL1909038）產(chǎn)地為四川，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》一部黃連項下相關(guān)要求[1]。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏粉的制備

依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》的相關(guān)規(guī)定[6]，確定黃連浸膏的制備方法為：取黃連藥材950 g，除去雜質(zhì)，潤透后切薄片，晾干，得黃連飲片[1]。取黃連飲片，加水煎煮2次，第1次加9倍水，浸泡30 min，加熱煎煮20 min，趁熱用350目篩網(wǎng)濾過；第2次加7倍水，加熱煎煮15 min，趁熱用350目篩網(wǎng)濾過，合并濾液，減壓濃縮至密度為1.08（80℃）的浸膏。將浸膏均分為4份，分別進行噴霧干燥（進風溫度180℃，出風溫度85℃）、冷凍干燥（-50℃，壓力10 Pa）、真空干燥（70℃）和鼓風干燥（70℃），在相對濕度為40%以下的環(huán)境中進行粉碎，過80目篩，得黃連浸膏粉。

2.2 浸膏粉物理指紋圖譜的研究

2.2.1 黃連浸膏粉物理指紋圖譜測定指標 黃連浸膏粉物理指紋圖譜以堆積性、流動性、穩(wěn)定性、均一性和可壓性這5個指標為一級指標。其中堆積性用堆密度（Da）和振實密度（Dc）表征；流動性用休止角（α）和豪斯納比（IH）表征；穩(wěn)定性用干燥失重（HR）和吸濕性（H）表征；均一性用相對均齊度指數(shù)（Iθ）表征，表示粉末粒徑大小及分布的均勻程度；可壓性用顆粒間孔隙度（Ie）、卡爾指數(shù)（IC）表征，表示粉末的壓縮成形的能力，通過以上9個二級指標構(gòu)建浸膏粉的物理指紋圖譜[7]。

2.2.2 各二級指標測量方法及計算公式

2.2.2.1 堆密度（Da）和振實密度（Dc）取25 mL量筒，稱取空筒質(zhì)量M1，緩慢加入過量待測粉末直至溢出，以接觸并垂直于量筒的刮刀，小心刮平后，稱取質(zhì)量M2；將上述盛有待測粉末的量筒固定在粉體振實密度儀中，經(jīng)1 250 s上下振動后讀取待測粉末的體積（V）。計算Da=(M2-M1)/25，Dc=(M2-M1)/V，即得。

2.2.2.2 休止角（α）和豪斯納比（IH）采用固定漏斗法進行測定。將漏斗水平放置并固定距離坐標紙一定的高度（h），緩慢將待測粉末倒入漏斗中，直至粉末的頂尖接觸到漏斗的頂尖位置。底部形成半徑為R的圓底錐積體。計算α=arctan( )

H/R，即得；IH=Dc/Da。

2.2.2.3 干燥失重（HR）和吸濕性（H）干燥失重（HR）：照2020年版《中國藥典》四部水分測定法（通則0832）第二法測定。吸濕性（H）：取干燥具塞玻璃稱量瓶，置于恒溫恒濕箱中，在溫度（25±1）℃，相對濕度（80±2）%中恒濕24 h后精密稱定質(zhì)量Ma；取待測黃連浸膏粉適量平鋪于上述玻璃稱量瓶中，厚度約為1 mm，精密稱定質(zhì)量Mb；將稱量瓶敞口，與瓶蓋同置于恒溫恒濕箱中24 h，稱定質(zhì)量Mc；按公式H=(Mc-Mb)/(Mb-Ma)×100%計算，即得。

2.2.2.4 相對均齊度指數(shù)（Iθ）使待測粉末依次過1~8號藥典篩，振蕩5 min，記錄每個篩網(wǎng)截留的粉末質(zhì)量。計算Iθ＝Fm/[100+（dm-dm‐1）Fm‐1+（dm+1-dm）Fm+1+（dm-dm‐2）Fm‐2+（dm+2-dm）Fm+2+...+（dm+n-dm）Fm+n]，即得；其中，F(xiàn)m為多數(shù)粒徑范圍粉末的質(zhì)量百分比，F(xiàn)m+1為多數(shù)粒徑范圍上一個篩網(wǎng)截留粉末的質(zhì)量百分比，F(xiàn)m‐1為多數(shù)粒徑范圍下一個篩網(wǎng)截留粉末的質(zhì)量百分比，dm為多數(shù)粒徑范圍粉末的平均粒徑，dm+1為多數(shù)粒徑范圍上一個篩網(wǎng)截留粉末的平均粒徑，dm‐1為多數(shù)粒徑范圍下一個篩網(wǎng)截留粉末的平均粒徑，n為粒徑范圍的個數(shù)。

2.2.2.5 顆粒間孔隙度（Ie）和卡爾指數(shù)（IC）按公式Ie=(Dc-Da)/(DaDc)和IC=(Dc-Da)/Dc，計算即得[6?9]。

2.2.3 物理指紋圖譜的構(gòu)建 取4種黃連浸膏粉，按“2.2.2”項下方法測定或計算各指標的實際值，將結(jié)果按表1中的公式進行轉(zhuǎn)化[7,10]，通過以上9個二級指標的轉(zhuǎn)化值構(gòu)建物理指紋圖譜，將其平均值構(gòu)圖作為對照圖譜（R），各實驗值見表2，轉(zhuǎn)化值見表3，物理指紋圖譜見圖1。

圖1 4種干燥方式黃連浸膏粉的物理指紋圖譜及對照指紋圖譜Figure 1 Physical fingerprint and reference fingerprint of Coptidis Rhizoma extract powder of four drying methods

表1 二級指標范圍及轉(zhuǎn)化公式Table 1 Rangeand transformation formulaof secondary indicators

表2 4種干燥方式黃連浸膏粉物理指紋圖譜指標實驗值Table 2 Experimental value of physical fingerprint index of Coptidis Rhizoma extract powder of four drying methods

表3 4種干燥方式黃連浸膏粉物理指紋圖譜指標轉(zhuǎn)化值Table 3 Transformation value of physical fingerprint index of Coptidis Rhizoma extract powder of four drying methods

2.2.4 相似度分析 采用SPSS 20.0軟件中皮爾遜相關(guān)系數(shù)法對4種干燥方式黃連浸膏粉的物理指紋圖譜（9個二級指標轉(zhuǎn)化值）與R進行相似度分析，結(jié)果分別為0.840（噴霧干燥粉）、0.802（冷凍干燥粉）、0.940（真空干燥粉）、0.915（鼓風干燥粉），表明不同干燥方式對黃連浸膏粉的物理指紋圖譜有一定影響，浸膏粉的物理性質(zhì)存在差異。

2.2.5 主成分分析 采用past3.0軟件對4種干燥方式黃連浸膏粉的物理指紋圖譜（9個二級指標轉(zhuǎn)化值）進行主成分分析，結(jié)果見表4、表5，物理指紋圖譜主成分因子載荷圖如圖2。由表4可知，軟件自動擬合出3個主成分，主成分1的特征值為11.11，方差貢獻率為79.60%，載荷較高的有Da、Dc、α、Ie，歸納主成分1為形態(tài)參數(shù)，說明主成分1主要反映粉體形態(tài)信息；主成分2的特征值為2.54，方差貢獻率為18.21%，載荷較高的有IH、HR、H、Iθ、IC，歸納主成分2為穩(wěn)定性參數(shù)，說明主成分2主要反映粉體的穩(wěn)定性，主成分1和主成分2累計方差貢獻率為97.81%，說明前2個主成分能基本反映全部指標的信息。上述載荷較高的值，可能是與干燥方式相關(guān)性較大的指標。

圖2 物理指紋圖譜主成分因子載荷圖Figure 2 Principal component factor loading diagrams of physical fingerprint

表4 物理指紋圖譜主成分分析結(jié)果Table 4 Results of principal component analysis of physical fingerprint

表5 物理指紋圖譜主成分因子載荷矩陣Table 5 Principal component factor loading matrix of physical fingerprint

2.2.6 聚類分析 采用SPSS 20.0軟件對4種干燥方式黃連浸膏粉的物理指紋圖譜（9個二級指標轉(zhuǎn)化值）進行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果可見，噴霧干燥粉和冷凍干燥粉聚為Ⅰ類，真空干燥粉和鼓風干燥粉聚為Ⅱ類，說明在黃連浸膏粉的物理屬性上，噴霧干燥粉和冷凍干燥粉相近，真空干燥粉和鼓風干燥粉相近。

圖3 物理指紋圖譜聚類分析（CA）樹狀圖Figure 3 Cluster analysis(CA)of physical fingerprint

2.2.7 壓縮成型性分析 由表3中4種干燥方式黃連浸膏粉物理指紋圖譜指標各二級指標的轉(zhuǎn)化值計算平均半徑值，從而求得可壓性評價指數(shù)，可對黃連浸膏粉的可壓縮性進行評價。可壓性評價指數(shù)包括參數(shù)輪廓指數(shù)（index of parametric profile,ⅠPP）、參數(shù)指數(shù)（index of parameter,ⅠP）和良好可壓性指數(shù)（index of good compression,ⅠGC）。其中ⅠPP為半徑值≥5的物理指標的個數(shù)占物理指紋譜中物理指標總數(shù)的百分比；ⅠP為所有物理指標半徑值的平均值；ⅠGC的計算公式為IGC=IPP×?，?=正多邊形面積/圓的面積（半徑為10），由于本研究構(gòu)建的物理指紋譜共采用9個物理指標值，因此?=0.921[7]。5個一級指標的平均半徑值及指數(shù)計算結(jié)果見表6。

文獻表明，當ⅠP＞0.4、ⅠPP≥4、ⅠGC≥4時，粉體具有良好的壓縮性；當ⅠP＜0.4、ⅠPP和ⅠGC＜4時，粉體壓縮成型性較差[7]。由表6結(jié)果可知，不同干燥方式對黃連浸膏粉的堆積性、均一性和可壓性影響均較大，噴霧干燥粉、真空干燥粉、鼓風干燥粉具有較好的壓縮成型性，冷凍干燥粉的壓縮成型性較差。

表6 4種干燥方式黃連浸膏粉壓縮成型性分析結(jié)果Table 6 Compressibility evaluation parameters of Coptidis Rhizoma extract powder of four drying methods

2.3 HPLC指紋圖譜

2.3.1 色譜條件[11]色譜柱為YMCTriart C18（250mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）?25 mmol/L乙酸銨和8 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（氨水調(diào)pH至9.3）（B），梯度洗脫（0~15 min，10%~25%A；15~25 min，

25%~30%A；25~45 min，30%~50%A；45~75 min，50%A）；柱溫為30℃；檢測波長為345 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含木蘭花堿90μg，鹽酸小檗堿50μg的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取黃連浸膏粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇?鹽酸（體積比100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHZ）30 min,放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 精密度試驗 取黃連浸膏粉適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以1號峰木蘭花堿（S1）為參照峰，計算峰2~峰4相對保留時間和相對峰面積的RSD，其范圍分別為0.45%~1.03%和0.97%~1.83%；以11號峰鹽酸小檗堿（S2）為參照峰，計算峰5~峰10相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.62%~1.36%和0.98%~1.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一浸膏粉樣品，按“2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，以1號峰木蘭花堿（S1）為參照峰，計算峰2~峰4的相對保留時間和相對峰面積的RSD，其范圍分別為1.04%~1.87%和0.97%~1.69%；以11號峰鹽酸小檗堿（S2）為參照峰，計算峰5~峰10的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.51%~1.02%和0.47%~1.25%，表明方法重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.4”項下供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h后按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，以1號峰木蘭花堿（S1）為參照峰，計算峰2~峰4的相對保留時間和相對峰面積的RSD，其范圍分別為0.69%~1.24%和0.85%~1.72%；以11號峰鹽酸小檗堿（S2）為參照峰，計算峰5~峰10的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為1.01%~1.57%和0.94%~1.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 指紋圖譜的采集 取4種黃連浸膏粉適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以1號峰木蘭花堿（S1）為參照峰，計算峰2、3、4與S1峰的相對保留時間，以11號峰鹽酸小檗堿（S2）為參照峰，計算峰5、6、7、8、9、10與S2峰的相對保留時間，結(jié)果見表7。通過比對保留時間，確定峰6、7、8、9、10分別為鹽酸藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀。4種黃連浸膏粉HPLC指紋圖譜各特征峰相對保留時間的RSD范圍為0.00%~0.32%，說明相對保留時間的差異極小。4種干燥方式黃連浸膏粉的HPLC指紋圖譜中“峰面積/取樣量”值見表8。其中，峰5、表小檗堿、黃連堿的RSD分別為9.13%、7.06%、7.18%，噴霧干燥粉和冷凍干燥粉均高于真空干燥粉和鼓風干燥粉，另外8個峰的RSD均在5%以內(nèi)。

表7 HPLC指紋圖譜相對保留時間Table 7 Relative retention time of HPLCfingerprints

表8 HPLC指紋圖譜“峰面積/取樣量”值Table 8“Peak area/sample volume”value of HPLCfingerprint

2.3.8 相似度分析 將4種黃連浸膏粉的色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”中，生成共有對照特征圖譜（R），計算相似度，相似度結(jié)果均為1.000，說明4種干燥方式黃連浸膏粉的HPLC指紋圖譜相差不大，見圖4。

圖4 4種干燥方式黃連浸膏粉指紋圖譜（A）及混合對照品圖譜（B）Figure 4 Fingerprints of Coptidis Rhizoma extract powder in four drying methods(A)and mixed referencesubstance(B)

2.3.9 聚類分析 采用SPSS 20.0軟件對4種干燥方式黃連浸膏粉HPLC指紋圖譜的“峰面積/取樣量”值進行聚類分析，如圖5所示。其中，噴霧干燥粉和冷凍干燥粉聚為Ⅰ類，真空干燥粉和鼓風干燥粉聚為Ⅱ類，與物理指紋圖譜聚類分析結(jié)果一致。

圖5 HPLC指紋圖譜聚類分析（CA）樹狀圖Figure 5 Clustering analysis(CA)of HPLCfingerprint

3 討論

浸膏粉是中藥制劑工藝的關(guān)鍵中間體，具有化學成分復雜、有效成分不明確的特點。采用有限的化學指標對浸膏粉進行定性定量控制存在一定局限，應關(guān)注其整體的理化性質(zhì)研究。物理指紋圖譜可從物理狀態(tài)層面整體評價中藥浸膏粉質(zhì)量，并可作為對中藥浸膏粉含量測定或HPLC指紋圖譜評價的補充，從而較為全面地對中藥浸膏粉質(zhì)量進行控制[12]。

本文通過測定和計算4種干燥方式所得黃連浸膏粉9個二級指標的轉(zhuǎn)化值，建立了物理指紋圖譜，并進行相似度評價、壓縮成型性分析、聚類分析、主成分分析。結(jié)果表明，干燥方式對粉體的堆積性、流動性、粒徑分布、顆粒間孔隙率等尺寸參數(shù)影響較大。粒徑大小是決定粉體其他性質(zhì)的最基本的性質(zhì)，粒徑的大小不同，粉體的吸附性、溶解度、流動性等都會隨之改變[13]。

由聚類分析結(jié)果可得，噴霧干燥粉和冷凍干燥粉聚為Ⅰ類，真空干燥粉和鼓風干燥粉聚為Ⅱ類；由壓縮成型性分析可得，噴霧干燥粉的壓縮成型性最好，冷凍干燥粉的壓縮成型性較差，分析其原因是噴霧干燥粉是密度較小的空心小球顆粒，輕拋，冷凍干燥粉疏松，真空干燥粉和鼓風干燥粉均較致密，體積小，粉碎的顆粒不規(guī)則。由“峰面積/取樣量”值可得，噴霧干燥粉與冷凍干燥粉的有效成分差異很小，均優(yōu)于真空干燥粉和鼓風干燥粉，分析其原因是冷凍干燥時樣品處于超低溫狀態(tài)，有利于成分的保留，而噴霧干燥進風溫度很高（180℃）但用時較短，成分也能較好地保留，真空干燥和鼓風干燥的干燥速率較噴霧干燥明顯慢，過程不穩(wěn)定，因此浸膏粉間成分有所差異[14]。在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》中，通常以標準煎液的凍干粉作為標準物質(zhì)來評價制備工藝，本研究結(jié)果表明噴霧干燥與凍干粉的化學成分更為一致，另外，噴霧干燥技術(shù)具有霧滴群表面積大、對流傳熱傳質(zhì)速度快、干燥時間短等優(yōu)點，大大簡化并縮短了中藥提取液到制劑成品或半成品的生產(chǎn)工藝和干燥時間，提高了生產(chǎn)效率[15?17]。綜合產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率，噴霧干燥較其他干燥方式具有一定的優(yōu)勢。

本文建立的黃連浸膏粉物理指紋圖譜在一定程度上可以預測浸膏粉壓縮成型的結(jié)果，但缺乏確切的試驗數(shù)據(jù)，后期可針對浸膏粉與對應顆粒的相關(guān)性進行研究，明確影響顆粒物理屬性的潛在關(guān)鍵物理指標，為黃連相關(guān)制劑的成型工藝優(yōu)化提供參考。